Los sistemas CRISPR-Cas se anuncian ampliamente como una nueva generación de herramientas genéticas. Pero el desarrollo de estas herramientas requiere que los investigadores identifiquen los motivos adyacentes a los protoespaciadores PAM que desbloquean la funcionalidad de cada sistema. Un nuevo conjunto de técnicas agiliza la identificación de PAM:y las primeras pruebas encuentran que muchos sistemas CRISPR-Cas en realidad tienen múltiples PAM de diferente potencia.
Los sistemas CRISPR-Cas protegen a las bacterias de invasores como los virus. Para ello, crean pequeñas hebras de ARN que coinciden con las secuencias de ADN específicas de un invasor determinado. Cuando esos ARN CRISPR encuentran una coincidencia, liberan proteínas que cortan el ADN del invasor., evitando que se replique. Sin embargo, el primer paso del proceso no es comparar el ARN con el ADN diana. El primer paso implica el reconocimiento y la unión de PAM.
Las PAM son secuencias genéticas cortas adyacentes al ADN diana en virus u otros invasores. Cuando la proteína en un sistema CRISPR-Cas identifica una PAM, esa identificación le dice a la proteína que se una a ese ADN y comience a comparar la secuencia de ADN adyacente con laARN CRISPR. Si el ADN y el ARN coinciden, la proteína escinde el ADN diana.
"Para que los investigadores hagan uso de un sistema CRISPR-Cas para la edición de genes, la regulación de genes u otras técnicas, primero debe identificar las secuencias PAM relevantes que desencadenan esa combinación específica de proteína CRISPR", dice Chase Beisel, un asistenteprofesor de ingeniería química y biomolecular en NC State University y autor principal de un artículo que describe el trabajo.
"Por ejemplo, la herramienta CRISPR-Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes tiene un PAM diferente al de la herramienta CRISPR-Cas9 derivada de Staphylococcus aureus", dice Beisel. "Hay miles de herramientas CRISPR potenciales por ahí; para hacer uso de ellasnecesitamos una forma eficiente de identificar sus PAM. Y creemos que hemos desarrollado herramientas para hacerlo ".
La identificación de PAM es complicada porque es difícil predecir qué secuencias genéticas funcionan como PAM para un sistema CRISPR-Cas dado. Y las secuencias genéticas que funcionan como PAM varían ampliamente, incluso entre sistemas CRISPR-Cas estrechamente relacionados. Por ejemplo, elLa PAM que activa la proteína Cas9 de S. pyogenes consta de solo tres nucleótidos, pero la PAM que activa la proteína Cas9 de S. aureus contiene seis nucleótidos, ninguno de los cuales se superpone con los de S. pyogenes.
"Para abordar este desafío, desarrollamos una herramienta llamada PAM-SCANR", dice Ryan Leenay, un estudiante graduado en el laboratorio de Beisel y autor principal del artículo. "PAM-SCANR nos permite identificar secuencias PAM para cualquier CRISPR-combinación de proteínas. "
Así es como funciona PAM-SCANR. Primero, los investigadores comienzan con un sistema CRISPR-Cas para el que quieren encontrar el PAM. El par de proteína CRISPR relevante se usa luego como agente reactivo en una pantalla de alto rendimiento que expone el CRISPR-proteínas a muchas secuencias de genes diferentes simultáneamente. Las secuencias de genes son parte de una construcción genética diseñada para iluminarse literalmente fluorescen cuando el par de proteínas CRISPR se une a ellas. Y eso solo puede suceder si un PAM funcional espresente.
"Una cosa que hace que esta herramienta sea única es que podría usarse para seleccionar e identificar PAM en una amplia gama de sistemas CRISPR-Cas", dice Leenay.
Los investigadores probaron PAM-SCANR en cinco sistemas CRISPR-Cas en tres de los cuatro tipos de CRISPR que se sabe que dependen de PAM para funcionar. Los diferentes tipos de CRISPR utilizan diferentes proteínas y dependen de diferentes mecanismos de acción.
Los investigadores también desarrollaron una herramienta llamada rueda PAM que ayuda a los investigadores a visualizar el resultado de las pantallas PAM-SCANR. También les permite ver si algunos PAM son mejores que otros y en qué medida.
Esto es importante porque, al probar PAM-SCANR, los investigadores encontraron que puede haber múltiples PAM para un sistema CRISPR-Cas dado, lo cual fue una sorpresa, y que algunos PAM desencadenan una respuesta mucho más fuerte que otros.
"Cuando descubrimos los PAM por primera vez hace casi una década, inicialmente pensamos que solo un PAM funcionaba", dice Rodolphe Barrangou, profesor asociado en el Departamento de Alimentos, Bioprocesamiento y Ciencias de la Nutrición del Estado de Carolina del Norte y autor principal del manuscrito ".Sin embargo, nuestras herramientas revelaron que puede haber múltiples PAM para un solo sistema CRISPR-Cas, y algunos PAM obtuvieron mejores resultados que otros como parte del reconocimiento de CRISPR de su ADN objetivo ".
Los investigadores ya están usando PAM-SCANR para identificar PAM para sistemas CRISPR-Cas que pueden ser la próxima generación de herramientas CRISPR. También están trabajando para determinar cómo diferentes PAM para un sistema CRISPR-Cas específico pueden afectar la efectividad de ese sistemaen cualquier aplicación dada.
"Por ejemplo, queremos saber si la variabilidad entre PAM tiene implicaciones para la edición del genoma y nuestra capacidad para predecir sitios fuera del objetivo, lugares que un sistema CRISPR-Cas podría atacar a otros que no sean el ADN objetivo", dice Beisel.
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Materiales proporcionado por Universidad Estatal de Carolina del Norte . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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