Los ingenieros biomédicos de la Universidad de Duke han desarrollado un método para mejorar la precisión de la tecnología de edición del genoma CRISPR en un promedio de 50 veces. Creen que se puede traducir fácilmente a cualquiera de los formatos de expansión continua de la tecnología de edición.
El enfoque agrega una cola corta al ARN guía que se usa para identificar una secuencia de ADN para editar. Esta cola adicional se pliega hacia atrás y se une a sí misma, creando un "bloqueo" que solo se puede deshacer mediante la secuencia de ADN objetivo.
El estudio aparece en línea el 15 de abril en la revista Biotecnología de la naturaleza .
"CRISPR es generalmente increíblemente preciso, pero hay ejemplos que han mostrado una actividad fuera del objetivo, por lo que ha habido un amplio interés en todo el campo en aumentar la especificidad", dijo Charles Gersbach, profesor asociado de ingeniería biomédica de la familia Rooney en Duke ".Pero las soluciones propuestas hasta ahora no se pueden traducir fácilmente entre diferentes sistemas CRISPR ".
CRISPR / Cas9 es un sistema de defensa que las bacterias usan para atacar y escindir el ADN de los virus invasores. Mientras que la primera versión de la tecnología CRISPR diseñada para funcionar en células humanas se originó de una bacteria llamada Streptococcus pyogenes, muchas más especies de bacterias tienen otras versiones.
Los científicos en el campo han pasado años buscando nuevos sistemas CRISPR con propiedades deseables y constantemente están agregando al arsenal CRISPR. Por ejemplo, algunos sistemas son más pequeños y están en mejores condiciones para encajar dentro de un vector viral para entregar genes a las células humanasterapia. Pero sin importar sus habilidades individuales, todos han producido ediciones genéticas no deseadas a veces.
Una propiedad universal de los sistemas CRISPR es su uso de moléculas de ARN como guías que se centran en la secuencia de ADN dirigida en el genoma. Una vez que un ARN guía encuentra su secuencia genética complementaria, la enzima Cas9 actúa como la tijera que hace el corteel ADN, facilitando los cambios en la secuencia del genoma. Pero debido a que cada secuencia de referencia tiene solo 20 nucleótidos de largo y el genoma humano contiene alrededor de tres mil millones de pares de bases, hay mucho que clasificar, y el CRISPR a veces puede cometer errores con las secuencias uno o dospares de bases por debajo de la perfección.
Una forma de mejorar la precisión de CRISPR es requerir que dos moléculas Cas9 se unan en lados opuestos de la misma secuencia de ADN para realizar un corte completo. Si bien este enfoque funciona, agrega más partes al sistema, aumentando su complejidad y haciendoes más difícil de entregar
Otro enfoque ha sido diseñar genéticamente la proteína Cas9 para que sea menos energética, por lo que es menos probable que se dispare y cometa un error. Si bien esto también ha mostrado resultados prometedores, este tipo de ingeniería de proteínas es laborioso y tales esfuerzos sonespecífico para cada sistema CRISPR.
"Parece que hay un nuevo sistema CRISPR que se descubre casi todas las semanas que tiene algún tipo de propiedad única que lo hace útil para una aplicación específica", dijo Gersbach. "Haciendo una amplia reingeniería cada vez que encontramos una nueva proteína CRISPRhacerlo más preciso no es una solución sencilla "
"Estamos enfocados en una solución que no agrega más partes y es general para cualquier tipo de sistema CRISPR", dijo Dewran Kocak, el estudiante de doctorado que trabaja en el laboratorio de Gersbach que dirigió este proyecto. "Lo que es común a todos los CRISPRsistemas es la guía de ARN, y estos ARN cortos son mucho más fáciles de diseñar ".
La solución de Gersbach y Kocak es extender el ARN guía hasta 20 nucleótidos de tal manera que se pliegue sobre sí mismo y se una al extremo del ARN guía original, formando una horquilla. Esto crea una especie de cerraduraeso es muy difícil de desplazar si incluso un solo par de bases es incorrecto en una secuencia de ADN que se analiza para detectar un posible corte, pero debido a que el ARN guía preferiría unirse al ADN en lugar de a sí mismo, la combinación correcta de ADN aún puede romperseLa cerradura.
"Podemos ajustar la fuerza de la cerradura lo suficiente para que el ARN guía todavía funcione cuando se encuentre con la combinación correcta", dijo Kocak.
En el documento, Kocak y Gersbach muestran que este método puede aumentar la precisión de los cortes que se realizan en las células humanas en un promedio de 50 veces en cinco sistemas CRISPR diferentes derivados de cuatro cepas bacterianas diferentes. Y en un caso esa mejora aumentóhasta más de 200 veces.
"Es una idea bastante simple a pesar de que Dewran completó varios años de investigación para demostrar que funciona de la manera que pensamos que está funcionando", dijo Gersbach. "Es una solución agradable y elegante para deshacerse de la actividad fuera del objetivo""
En el futuro, los investigadores esperan ver con cuántas variantes CRISPR diferentes podría funcionar este enfoque, así como completar una caracterización en profundidad de cómo funciona exactamente el mecanismo de bloqueo para ver si hay diferencias entre las variantes CRISPR. Y porque estosse realizaron experimentos en células cultivadas, los investigadores están ansiosos por ver qué tan bien este enfoque podría aumentar la precisión CRISPR dentro de un modelo animal real de enfermedad.
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Materiales proporcionados por Universidad de Duke . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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