Los científicos de la Escuela de Medicina de Harvard y el Hospital de Niños de Boston han utilizado un enfoque novedoso de edición de genes para salvar la audición de ratones con pérdida auditiva genética y han logrado hacerlo sin ningún efecto aparente fuera del objetivo como resultado del tratamiento.
Los animales, conocidos como ratones Beethoven, fueron tratados por la misma mutación genética que causa una pérdida auditiva progresiva en los humanos, que culminó en una sordera profunda a mediados de los 20 años.
El nuevo enfoque, descrito en línea el 3 de julio en medicina natural , implica una versión optimizada y más precisa del clásico sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 que es mejor para reconocer la mutación causante de enfermedades observada en los ratones Beethoven. La herramienta refinada permitió a los científicos desactivar selectivamente la copia defectuosa de un gen auditivollamado Tmc1, mientras se ahorra la copia saludable.
En particular, informan los investigadores, su sistema logró reconocer una sola letra de ADN incorrecta en la copia defectuosa entre 3 mil millones de letras en el genoma del ratón.
Los investigadores advirtieron que aún queda mucho trabajo por hacer incluso antes de que una terapia de edición genética tan precisa como esta pueda usarse en humanos. Sin embargo, dijeron, el trabajo representa un hito porque mejora en gran medida la eficacia y seguridad detécnicas estándar de edición de genes.
"Nuestros resultados demuestran que esta versión más refinada y mejor enfocada de la herramienta de edición CRISPR / Cas9 ahora clásica logra un nivel de identificación y precisión sin precedentes", dijo el investigador co-investigador principal David Corey, profesor de ciencias médicas traslacionales de Bertarelli.en el Instituto Blavatnik de la Facultad de Medicina de Harvard.
Además, dijo el equipo, los resultados prepararon el escenario para usar el mismo enfoque de precisión para tratar otras enfermedades genéticas heredadas predominantemente que surgen de una sola copia defectuosa de un gen.
Todos heredan dos copias del mismo gen, una de cada padre. En muchos casos, un gen normal es suficiente para asegurar la función normal que salva al individuo de la enfermedad. Por el contrario, en los llamados trastornos genéticos heredados predominantemente, unUna sola copia defectuosa puede causar enfermedades.
"Creemos que nuestro trabajo abre la puerta hacia una forma hiper-dirigida para tratar una variedad de trastornos genéticos que surgen de una copia defectuosa de un gen", dijo el investigador co-investigador principal Jeffrey Holt, profesor de otorrinolaringología de la Facultad de Medicina de Harvard yneurología en el Boston Children's Hospital, que también está afiliado al Centro de Neurobiología FM Kirby en el Boston Children's. "Esto realmente es medicina de precisión".
Los ratones que portan el gen Tmc1 defectuoso se conocen como ratones Beethoven porque el curso de su enfermedad imita la pérdida auditiva progresiva experimentada por el famoso compositor. Sin embargo, la causa de la sordera de Ludwig van Beethoven sigue siendo una cuestión de especulación.
En ratones, el defecto de Beethoven está marcado por una letra incorrecta en la secuencia de ADN del gen Tmc1, una A en lugar de una T, un solo error que explica la diferencia entre la audición normal y la sordera.
Deshabilitar o silenciar, la copia mutante del gen Tmc1 sería suficiente para preservar la audición del animal, pero ¿cómo podría hacerse sin deshabilitar inadvertidamente el gen sano también?
Dos llaves son mejores que una
Los sistemas de edición de genes CRISPR-Cas9 clásicos funcionan mediante el uso de una molécula guía, gRNA, para identificar la secuencia de ADN mutante objetivo. Una vez que se identifica el ADN objetivo, la enzima de corte Cas9 lo corta.
Hasta ahora, estos editores de genes han mostrado una precisión menos que perfecta. Esto se debe a que el ARN guía que conduce la enzima Cas9 al sitio objetivo y la enzima Cas9 que corta el ADN objetivo no son del todo precisas y podrían terminar cortandoel ADN equivocado
Para sortear estos desafíos, los investigadores adaptaron una herramienta desarrollada originalmente por Keith Joung, profesor de patología del HMS, y Ben Kleinstiver, profesor asistente de patología del HMS, en el Hospital General de Massachusetts, que utiliza una enzima Cas9 modificada derivada de Staphylococcus aureus en lugar delCas9 estándar que se deriva de la bacteria Streptococcus pyogenes.
Para lograr una mayor precisión de la detección y la interrupción, el nuevo sistema optimizado combina dos niveles de reconocimiento: ARNg para localizar el gen objetivo y una forma modificada de Cas9 que puede identificar la mutación de ADN específica en ratones Beethoven. El uso dedos formas de identificación aseguran el corte preciso y selectivo de la copia aberrante, y solo la copia aberrante, de ese gen.
"Aprovechamos el hecho de que este sistema reconoce el ADN mutante pero no el ADN normal y utiliza un sistema de reconocimiento dual para una mayor precisión", dijo el primer autor del estudio, Bence Gyorgy, quien realizó el trabajo mientras estaba en la Facultad de Medicina de Harvard y ahora está enInstituto de Oftalmología Molecular y Clínica en Basilea, Suiza. "Este enfoque dio como resultado un nivel de especificidad sin precedentes en la orientación del gen mutante".
En un conjunto inicial de experimentos en células con y sin la mutación de Beethoven, la herramienta distinguió con precisión entre el ADN mutante y el ADN normal en copias del gen Tmc1. Un análisis posterior reveló que en las células de Beethoven, que contenían una copia defectuosa y una normaldel gen, al menos el 99 por ciento de los "cortes" moleculares ocurrieron exclusivamente en la copia defectuosa del gen.
Luego, los investigadores inyectaron el tratamiento de edición de genes en los oídos internos de los ratones con y sin la mutación de Beethoven. El análisis de ADN mostró que la actividad de edición se produjo solo en las células del oído interno de los ratones con el defecto de Beethoven. No se detectaron cambios de edición encélulas del oído interno de ratones tratados que no tenían la mutación, un hallazgo que confirmó la precisión de la herramienta.
Para determinar si la terapia de edición de genes interfirió con la función normal de los genes, los científicos estimularon las células auditivas, llamadas células ciliadas, de los oídos internos de los ratones tratados que no portaban el defecto de Beethoven. Las células se mostraron sin cambios, normalesescuchar las respuestas, afirmando que la terapia de edición de genes no tuvo ningún efecto sobre la función normal de los genes.
Silenciando a Beethoven
Para medir si la terapia funcionó en animales en lugar de solo en células, los investigadores realizaron la prueba estándar de oro para la audición. Midieron las respuestas auditivas del tronco encefálico de los animales, que capturan cuánto sonido detectan las células ciliadas en el oído interno ytransmitido al cerebro.
Sin tratamiento, los ratones Beethoven generalmente están completamente sordos a los 6 meses de edad. En comparación, los ratones sin el defecto genético conservan la audición normal durante toda la vida y pueden detectar sonidos a alrededor de 30 decibelios, un nivel similar a un susurro.
Dos meses después de recibir la terapia de edición de genes, los ratones Beethoven mostraron una audición notablemente mejor que los hermanos no tratados que portaban la mutación genética. Los animales tratados fueron capaces de detectar sonidos a aproximadamente 45 decibelios, el nivel de una conversación normal, o aproximadamente16 veces más silencioso que los ratones no tratados. El ratón Beethoven con la mayor preservación auditiva era capaz de escuchar sonidos de 25 a 30 decibelios, prácticamente indistinguible de sus pares sanos.
Tomados en conjunto, los hallazgos demuestran que la nueva terapia génica silenció efectivamente la copia defectuosa del gen y rescató la audición de los animales de la desaparición rápida típicamente vista en la enfermedad.
Debido a que la enfermedad está marcada por una pérdida auditiva progresiva, los investigadores evaluaron el efecto de la terapia sobre la progresión durante varios meses. Los investigadores administraron el tratamiento poco después del nacimiento y evaluaron los niveles de audición en ratones tratados y no tratados con y sin la mutación cada cuatro semanas durantehasta seis meses. En el primer mes, los ratones Beethoven no tratados podían escuchar sonidos de baja frecuencia pero tenían una pérdida auditiva notable en las frecuencias altas. Al mes seis después del nacimiento, los ratones Beethoven no tratados habían perdido toda su audición. En contraste, los ratones Beethoven tratados se mantuvieron cercaaudición normal a bajas frecuencias, algunas con audición casi normal incluso a altas frecuencias.
Notablemente, los animales tratados que no portaban el defecto genético no experimentaron ninguna pérdida auditiva como resultado de la terapia génica, un hallazgo que demostró la seguridad del procedimiento y su capacidad para atacar selectivamente la copia aberrante del genAún más alentador, un pequeño subconjunto de ratones Beethoven tratados que fueron seguidos durante casi un año conservaron una audición estable y casi normal.
Debido a que el defecto de Beethoven está marcado por el deterioro progresivo y la muerte de las células auditivas en el oído interno, los investigadores utilizaron la microscopía electrónica para visualizar la estructura de estas células auditivas críticas. Como era de esperar, en los ratones Beethoven no tratados, los investigadores vieron gradualmentepérdida de células auditivas junto con deterioro en su estructura. Por el contrario, los ratones Beethoven tratados y los ratones sanos tratados retuvieron un número normal de células auditivas con estructura intacta o casi intacta.
En un experimento final, los científicos probaron el efecto del tratamiento en una línea de células humanas que portaban la mutación de Beethoven. El análisis de ADN reveló que el tratamiento causó la edición exclusivamente en la copia mutante del gen Tmc1 y evitó la normal.
Debido a su capacidad para atacar mutaciones genéticas de un solo punto, el enfoque es prometedor para otras 15 formas de sordera hereditaria también causadas por una mutación de una letra en la secuencia de ADN de otros genes auditivos.
Además, dijo el equipo, su técnica podría adaptarse para su uso en otras enfermedades genéticas dominantemente heredadas causadas por mutaciones de un solo punto. Para determinar su utilidad hipotética, los científicos escanearon la base de datos federal ClinVar, un depósito nacional de todos los genes genéticos conocidosmutaciones vinculadas a enfermedades humanas. El análisis mostró que, basándose en la especificidad de la herramienta, podía identificar correctamente 3.759 variantes genéticas defectuosas, responsables colectivamente de una quinta parte de las mutaciones genéticas humanas dominantes.
"Sin duda, este es el primer paso en un largo viaje", dijo Holt. "Pero lo que tenemos aquí es una prueba de principio que demuestra que este tratamiento altamente específico y altamente específico podría desarrollarse para silenciar selectivamente los genes que transportan solosmutaciones puntuales y potencialmente tratar muchas otras formas de enfermedad humana ".
Los coinvestigadores incluyeron a Carl Nist-Lund, Bifeng Pan, Yukako Asai, K.Domenica Karavitaki, Benjamin Kleinstiver, Sara García, Mikolaj Zaborowski, Paola Solanes, Sofia Spataro, Bernard Schneider, Keith Joung y Gwenaelle Geleoc.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Escuela de Medicina de Harvard . Original escrito por Ekaterina Pesheva. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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