Los científicos están encontrando nuevas formas de mejorar el uso de la enzima CRISPR Cas9 y reducir las posibilidades de mutaciones fuera del objetivo en ratones de laboratorio, según los nuevos resultados de una colaboración de investigación que incluye a Lauryl Nutter, PhD, Director Senior, Desarrollo de Ciencia y Tecnologíaen el Centro de Fenogenómica del Hospital para Niños Enfermos SickKids en Toronto. Los hallazgos, que ayudan a los científicos a contextualizar una preocupación común relacionada con la edición de genes e identificar nuevas estrategias para mejorar su precisión, se presentaron como un resumen plenario presentado en el AmericanReunión anual de la Society of Human Genetics 2019 en Houston.
La Dra. Nutter y sus colaboradores del Proyecto de Fenotipación de Ratones Knockout de varias instituciones KOMP2 utilizan regularmente Cas9 y la edición de genes para producir líneas de ratones de laboratorio con mutaciones específicas. En este trabajo, a menudo encuentran preguntas sobre la probabilidad de que se produzcanmutagénesis objetivo - mutaciones genéticas no intencionadas introducidas por el proceso de edición de genes - en sus líneas de ratón.
"Queríamos saber: ¿hasta qué punto debemos preocuparnos por la mutagénesis fuera del objetivo?", Explicó el Dr. Nutter. Al demostrar el grado del problema en ratones, los investigadores esperaban poder evaluarlo mejor en humanoslas líneas celulares que se estudian en el laboratorio, así como también generan nuevas formas de mejorar la precisión de la edición de genes basada en Cas9.
Para responder a estas preguntas, el equipo del Dr. Nutter realizó 58 experimentos de edición del genoma en embriones de ratón con Cas9 y guió los ARN configurados para inducir una mutación específica y dirigida en un gen diferente, que se transmitiría a sus descendientes. De dos a cuatro guíasse usaron para cada experimento para un total de 175 ARN guía diferentes. Luego secuenciaron el genoma completo de cada ratón para buscar cualquier mutación adicional que pudiera haber resultado. Para obtener una tasa de mutación de línea de base, los genomas completos de las líneas de ratón tratadas con Cas9 fueronen comparación con los de 25 ratones de control no tratados.
En 31 de las líneas de ratón tratadas con Cas9, los investigadores encontraron cero mutaciones fuera del objetivo, y en las 20 líneas restantes, encontraron un promedio de 2.3 mutaciones fuera del objetivo. En comparación, entre las líneas de ratón tratadas y no tratadas, encontraron un promedio de 3,500 mutaciones únicas y naturales en cada animal.
"Sorprendentemente, estos resultados muestran que la cantidad de mutaciones naturales excedió con creces las introducidas por Cas9", dijo el Dr. Nutter. "También muestran que cuando los ARN guía están diseñados adecuadamente, la mutagénesis fuera del objetivo es bastante rara".
Los resultados también agregan contexto al uso de líneas endogámicas de ratones de laboratorio en la investigación genética y las suposiciones que hacen los científicos al usarlas.
"Históricamente, hemos utilizado líneas endogámicas para ratones para estudiar la genética en ratones porque sus genomas diferían solo en ciertos lugares definidos, y asumimos que cualquier diferencia entre los ratones se debe a esas diferencias", explicó el Dr. Nutter."Sin embargo, descubrimos que incluso entre los ratones en la misma camada, podría haber miles de diferencias genéticas naturales".
"Nuestros resultados resaltan la necesidad de ser conscientes del uso de Cas9 y otras herramientas en un genoma que puede no estar tan bien definido como pensamos", agregó.
Como próximos pasos, la Dra. Nutter y sus colaboradores planean explorar si las enzimas que inhiben o mejoran la reparación del ADN pueden afectar la velocidad a la que surgen nuevas mutaciones. También planean examinar la compensación entre mejorar la eficiencia de la mutagénesis Cas9 y mejorar suPrecisión: dado su enfoque en la producción de líneas de ratones de laboratorio, los investigadores esperan que sus hallazgos informen el desarrollo de mejores ARN guía, los fragmentos cortos de ARN que permiten que Cas9 se una al objetivo deseado e induzca la mutación deseada.
En términos más generales, esperan que sus hallazgos conduzcan a un mejor uso de los grupos de control y una perspectiva más informada sobre el diseño experimental. Observaron que este conocimiento será particularmente importante en la investigación de edición de genes con posibles aplicaciones terapéuticas, incluidos los estudios de seguridad yeficacia de las terapias basadas en genética.
Referencia: L Nutter et al . 18 de octubre de 2019. Resumen: La secuenciación del genoma completo pone la mutagénesis fuera del objetivo de Cas9 en el contexto de la deriva genética. Presentado en la Reunión Anual 2019 de la Sociedad Americana de Genética Humana. Houston, Texas.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Sociedad Americana de Genética Humana . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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