Durante gran parte de la historia de la humanidad, se percibió que los animales y las plantas seguían un conjunto de reglas diferente al resto del universo. En los siglos XVIII y XIX, esto culminó en la creencia de que los organismos vivos estaban infundidos por una energía no físicao "fuerza vital" que les permitió realizar transformaciones notables que no podrían ser explicadas por la química o la física convencionales por sí solas.
Los científicos ahora comprenden que estas transformaciones son impulsadas por enzimas, moléculas de proteínas compuestas por cadenas de aminoácidos que actúan para acelerar o catalizar la conversión de un tipo de molécula sustratos en otro productos. Al hacerlo,, permiten reacciones como la digestión y la fermentación, y todos los eventos químicos que suceden en cada una de nuestras células, que, si se dejan solos, sucederían extraordinariamente lentamente.
"Una reacción química que tardaría más que la vida del universo en ocurrir por sí sola puede ocurrir en segundos con la ayuda de enzimas", dijo Polly Fordyce, profesora asistente de bioingeniería y genética en la Universidad de Stanford.
Si bien ahora se sabe mucho sobre las enzimas, incluidas sus estructuras y los grupos químicos que utilizan para facilitar las reacciones, los detalles que rodean cómo sus formas se conectan con sus funciones y cómo llevan a cabo su magia bioquímica con una velocidad y especificidad tan extraordinarias aún no se conocen.no bien entendido.
Una nueva técnica, desarrollada por Fordyce y sus colegas en Stanford y detallada esta semana en la revista ciencia , podría ayudar a cambiar eso. Apodada HT-MEK, abreviatura de cinética de enzimas microfluídicas de alto rendimiento, la técnica puede comprimir años de trabajo en solo unas pocas semanas al permitir que miles de experimentos enzimáticos se realicen simultáneamente ".nuestra capacidad para hacer suficientes experimentos nos ha impedido diseccionar y comprender realmente las enzimas ", dijo el colíder del estudio, Dan Herschlag, profesor de bioquímica en la Facultad de Medicina de Stanford.
Al permitir a los científicos sondear en profundidad más allá del pequeño "sitio activo" de una enzima donde se produce la unión del sustrato, HT-MEK podría revelar pistas sobre cómo incluso las partes más distantes de las enzimas trabajan juntas para lograr su notable reactividad.
"Es como si ahora estuviéramos tomando una linterna y en lugar de simplemente enfocarla en el sitio activo, la estamos enfocando sobre toda la enzima", dijo Fordyce. "Cuando hicimos esto, vimos muchas cosas que no vimos.no esperes. "
Trucos enzimáticos
HT-MEK está diseñado para reemplazar un laborioso proceso para purificar enzimas que tradicionalmente ha involucrado la ingeniería de bacterias para producir una enzima en particular, cultivarlas en vasos de precipitados grandes, reventar los microbios y luego aislar la enzima de interés de todas las demás células no deseadascomponentes. Para reconstruir cómo funciona una enzima, los científicos introducen errores intencionales en su patrón de ADN y luego analizan cómo estas mutaciones afectan la catálisis.
Sin embargo, este proceso es costoso y requiere mucho tiempo, así que como una audiencia absorta en las manos de un mago durante un truco de magia, los investigadores han limitado principalmente sus investigaciones científicas a los sitios activos de las enzimas. "Sabemos mucho sobre elparte de la enzima donde ocurre la química porque la gente ha hecho mutaciones allí para ver qué sucede. Pero eso ha llevado décadas ", dijo Fordyce.
Pero como cualquier conocedor de trucos de magia sabe, la clave para una ilusión exitosa puede estar no solo en las acciones de los dedos del mago, sino que también puede involucrar el posicionamiento hábil de un brazo o el torso, un golpeteo mal dirigido o acciones discretas que suceden.fuera del escenario, invisible para el público. HT-MEK permite a los científicos cambiar fácilmente su mirada hacia partes de la enzima más allá del sitio activo y explorar cómo, por ejemplo, cambiar la forma de la superficie de una enzima podría afectar el funcionamiento de su interior.
"En última instancia, nos gustaría hacer trucos enzimáticos nosotros mismos", dijo Fordyce. "Pero el primer paso es averiguar cómo se hace antes de que podamos aprender a hacerlo".
Experimentos enzimáticos en un chip
HT-MEK combina dos tecnologías existentes para acelerar rápidamente el análisis enzimático. La primera es la microfluídica, que consiste en moldear chips de polímero para crear canales microscópicos para la manipulación precisa de fluidos ". La microfluídica reduce el espacio físico para realizar estos experimentos fluídicos en elDe la misma manera que los circuitos integrados redujeron el espacio necesario para la computación ", dijo Fordyce." En enzimología, todavía estamos haciendo cosas en estos frascos gigantes del tamaño de un litro. Todo es un volumen enorme y no podemos hacer muchas cosas a la vez."
El segundo es la síntesis de proteínas sin células, una tecnología que toma solo las piezas cruciales de la maquinaria biológica necesarias para la producción de proteínas y las combina en un extracto espeso que se puede utilizar para crear enzimas de forma sintética, sin necesidad de que las células vivas sirvan como incubadoras..
"Lo hemos automatizado para que podamos usar impresoras para depositar manchas microscópicas de ADN sintético que codifica la enzima que queremos en un portaobjetos y luego alinear cámaras del tamaño de nanolitros llenas de la mezcla de inicio de proteínas sobre las manchas", Fordyceexplicado.
Debido a que cada pequeña cámara contiene solo una milésima de millonésima parte de un litro de material, los científicos pueden diseñar miles de variantes de una enzima en un solo dispositivo y estudiarlas en paralelo. Al ajustar las instrucciones de ADN en cada cámara, puedenmodificar las cadenas de moléculas de aminoácidos que componen la enzima. De esta manera, es posible estudiar sistemáticamente cómo las diferentes modificaciones de una enzima afectan su plegamiento, capacidad catalítica y capacidad para unirse a moléculas pequeñas y otras proteínas.
Cuando el equipo aplicó su técnica a una enzima bien estudiada llamada PafA, descubrieron que las mutaciones mucho más allá del sitio activo afectaban su capacidad para catalizar reacciones químicas; de hecho, la mayoría de los aminoácidos o "residuos" que componenla enzima tuvo efectos.
Los científicos también descubrieron que un número sorprendente de mutaciones causaron que PafA se doblara incorrectamente en un estado alternativo que no podía realizar la catálisis. "Los bioquímicos han sabido durante décadas que puede ocurrir un plegado incorrecto, pero ha sido extremadamente difícil identificar estos casos e incluso más difícilpara estimar cuantitativamente la cantidad de estas cosas mal dobladas ", dijo el coautor del estudio, Craig Markin, un científico investigador con nombramientos conjuntos en los laboratorios de Fordyce y Herschlag.
"Esta es una enzima entre miles y miles", enfatizó Herschlag. "Esperamos que haya más descubrimientos y más sorpresas".
Acelerando avances
Si se adopta ampliamente, HT-MEK no solo podría mejorar nuestra comprensión básica de la función enzimática, sino también catalizar los avances en la medicina y la industria, dicen los investigadores. "Muchos de los químicos industriales que usamos ahora son malos para el medio ambiente y sonno es sostenible. Pero las enzimas funcionan de manera más efectiva en la sustancia más benigna para el medio ambiente que tenemos: el agua ", dijo el coautor del estudio, Daniel Mokhtari, un estudiante graduado de Stanford en los laboratorios de Herschlag y Fordyce.
HT-MEK también podría acelerar un enfoque para el desarrollo de fármacos llamado dirección alostérica, cuyo objetivo es aumentar la especificidad del fármaco dirigiéndose más allá del sitio activo de una enzima. Las enzimas son dianas farmacéuticas populares debido al papel clave que desempeñan en los procesos biológicos. Pero algunas sonse consideran "no farmacológicos" porque pertenecen a familias de enzimas relacionadas que comparten los mismos sitios activos o muy similares, y dirigirse a ellos puede provocar efectos secundarios. La idea detrás de la focalización alostérica es crear fármacos que se puedan unir a partes de enzimas que tienden aser más diferenciados, como sus superficies, pero aún controlan aspectos particulares de la catálisis. "Con PafA, vimos conectividad funcional entre la superficie y el sitio activo, por lo que nos da la esperanza de que otras enzimas tendrán objetivos similares", dijo Markin.Si podemos identificar dónde están los objetivos alostéricos, entonces podremos comenzar con el trabajo más difícil de diseñar medicamentos para ellos ".
La gran cantidad de datos que se espera que genere HT-MEK también será de gran ayuda para los enfoques computacionales y los algoritmos de aprendizaje automático, como el proyecto AlphaFold financiado por Google, diseñado para deducir la complicada forma 3D de una enzima a partir de su secuencia de aminoácidos únicamente."Para que el aprendizaje automático tenga alguna posibilidad de predecir con precisión la función de la enzima, necesitará el tipo de datos que HT-MEK puede proporcionar para entrenar", dijo Mokhtari.
Mucho más adelante, HT-MEK puede incluso permitir a los científicos realizar ingeniería inversa de enzimas y diseñar variedades propias a medida. "Los plásticos son un gran ejemplo", dijo Fordyce. "Nos encantaría crear enzimas que puedan degradar los plásticosen piezas no tóxicas e inofensivas. Si fuera realmente cierto que la única parte de una enzima que importa es su sitio activo, entonces ya podríamos hacer eso y más. Mucha gente lo ha intentado y ha fallado, y se cree queLa razón por la que no podemos es porque el resto de la enzima es importante para que el sitio activo tenga la forma correcta y se mueva de la manera correcta ".
Herschlag espera que la adopción de HT-MEK entre los científicos sea rápida. "Si usted es un enzimólogo que intenta aprender sobre una nueva enzima y tiene la oportunidad de observar 5 o 10 mutaciones durante seis meses o 100 o 1,000 mutantesde su enzima durante el mismo período, ¿cuál elegiría? ", dijo." Esta es una herramienta que tiene el potencial de suplantar los métodos tradicionales para toda una comunidad ".
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