Las proteínas informadoras codificadas genéticamente han sido un pilar de la investigación biotecnológica, lo que permite a los científicos rastrear la expresión génica, comprender los procesos intracelulares y depurar circuitos genéticos diseñados.
Pero los esquemas de informes convencionales que se basan en la fluorescencia y otros enfoques ópticos vienen con limitaciones prácticas que podrían ensombrecer el progreso futuro del campo. Ahora, investigadores de la Universidad de Washington y Microsoft han creado un "nanoporo-tal" en lo que esque ocurre dentro de estos complejos sistemas biológicos, lo que permite a los científicos ver las proteínas informadoras desde una perspectiva completamente nueva.
El equipo introdujo una nueva clase de proteínas informadoras que se pueden leer directamente con un dispositivo sensor de nanoporos disponible comercialmente. El nuevo sistema, denominado "Etiquetas de proteínas direccionables por nanoporos diseñadas como informadoras" o "NanoporeTERs", puede detectar múltiples niveles de expresión de proteínas.de cultivos de células bacterianas y humanas mucho más allá de la capacidad de las técnicas existentes.
El estudio se publicó el 12 de agosto en Biotecnología de la naturaleza.
"Los NanoporeTERs ofrecen un léxico nuevo y más rico para que las células diseñadas se expresen y arrojen nueva luz sobre los factores que están diseñados para rastrear. Pueden decirnos mucho más sobre lo que está sucediendo en su entorno de una sola vez", dijo el co-autor principal Nicolas Cardozo, estudiante de doctorado en el Instituto de Ciencias e Ingeniería Molecular de la Universidad de Washington.eficiencia que permitirá un análisis más profundo de lo que podíamos hacer antes ".
Para los métodos de etiquetado convencionales, los investigadores pueden rastrear solo unas pocas proteínas informadoras ópticas, como la proteína verde fluorescente, simultáneamente debido a sus propiedades espectrales superpuestas. Por ejemplo, es difícil distinguir entre más de tres colores diferentes de proteínas fluorescentes a la vez.En contraste, los NanoporeTERs fueron diseñados para llevar "códigos de barras" de proteínas distintos compuestos por cadenas de aminoácidos que, cuando se usan en combinación, permiten al menos diez veces más posibilidades de multiplexación.
Estas proteínas sintéticas se secretan fuera de una célula al entorno circundante, donde los investigadores pueden recolectarlas y analizarlas utilizando una matriz de nanoporos disponible comercialmente. Aquí, el equipo utilizó el dispositivo Oxford Nanopore Technologies MinION.
Los investigadores diseñaron las proteínas NanoporeTER con "colas" cargadas para que un campo eléctrico las pueda introducir en los sensores nanoporeTER. Luego, el equipo utiliza el aprendizaje automático para clasificar las señales eléctricas de cada código de barras NanoporeTER a fin de determinar la salida de cada proteína.niveles.
"Esta es una interfaz fundamentalmente nueva entre las células y las computadoras", dijo el autor principal Jeff Nivala, profesor asistente de investigación de la Universidad de Washington en la Escuela de Ingeniería y Ciencias de la Computación Paul G. Allen. "Una analogía que me gusta hacer es que la proteína fluorescentelos reporteros son como faros y los NanoporeTER son como mensajes en una botella.
"Los faros son realmente útiles para comunicar una ubicación física, ya que literalmente puedes ver de dónde proviene la señal, pero es difícil incluir más información en ese tipo de señal. Un mensaje en una botella, por otro lado, puedeempaque mucha información en un recipiente muy pequeño, y puede enviar muchos de ellos a otra ubicación para que los lean. Es posible que pierda de vista la ubicación física precisa donde se enviaron los mensajes, pero para muchas aplicaciones eso no va a serun problema."
Como prueba de concepto, el equipo desarrolló una biblioteca de más de 20 etiquetas NanoporeTERs distintas. Pero el potencial es significativamente mayor, según la coautora principal Karen Zhang, ahora estudiante de doctorado en el programa de posgrado en bioingeniería UC Berkeley-UCSF.
"Actualmente estamos trabajando para aumentar la cantidad de NanoporeTERs a cientos, miles, tal vez incluso millones más", dijo Zhang, quien se graduó este año de la Universidad de Washington con una licenciatura en bioquímica y microbiología. "Cuanto más tenemos,cuantas más cosas podamos rastrear.
"Estamos particularmente entusiasmados con el potencial de la proteómica unicelular, pero esto también podría ser un cambio de juego en términos de nuestra capacidad para realizar biosensores multiplexados para diagnosticar enfermedades e incluso dirigir la terapéutica a áreas específicas del interior del cuerpo. Ydepurar diseños de circuitos genéticos complicados sería mucho más fácil y consumiría mucho menos tiempo si pudiéramos medir el rendimiento de todos los componentes en paralelo en lugar de mediante prueba y error ".
Estos investigadores han hecho un uso novedoso del dispositivo MinION antes, cuando desarrollaron un sistema de etiquetado molecular para reemplazar los métodos de control de inventario convencionales. Ese sistema se basaba en códigos de barras que comprenden hebras sintéticas de ADN que se pueden decodificar a pedido con el lector portátil.
Esta vez, el equipo dio un paso más.
"Este es el primer artículo que muestra cómo un dispositivo sensor de nanoporos comercial puede reutilizarse para aplicaciones distintas a la secuenciación de ADN y ARN para la que fueron diseñados originalmente", dijo la coautora Kathryn Doroschak, bióloga computacional de Adaptive Biotechnologies, quiencompletó este trabajo como estudiante de doctorado en la Escuela Allen. "Esto es emocionante como un precursor de que la tecnología de nanoporos se vuelva más accesible y ubicua en el futuro. Ya puede conectar un dispositivo de nanoporos a su teléfono celular. Podría imaginarme algún día tener una opciónde 'aplicaciones moleculares' que serán relativamente económicas y estarán ampliamente disponibles fuera de la genómica tradicional ".
Los coautores adicionales del artículo son Aerilynn Nguyen en Northeastern University y Zoheb Siddiqui en Amazon, ambos ex estudiantes de pregrado de la UW; Nicholas Bogard en Patch Biosciences, un ex asociado de investigación postdoctoral de la UW; Luis Ceze, profesor de la Escuela Allen; y KarinStrauss, profesor afiliado de Allen School y director de investigación principal senior de Microsoft. Esta investigación fue financiada por la National Science Foundation, los Institutos Nacionales de Salud y un acuerdo de investigación patrocinado por Oxford Nanopore Technologies.
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