Una técnica desarrollada recientemente conocida como microscopía de fluorescencia de lámina de luz ha llevado a muchos descubrimientos biológicos al permitir a los investigadores crear imágenes tridimensionales de tejido, incluso embriones de animales vivos, usando etiquetas fluorescentes. Ahora, los investigadores informan la capacidad de aumentar las imágenesProfundidad de microscopía de fluorescencia de lámina de luz con el uso de un fenómeno óptico conocido como absorción de tres fotones.
En la revista The Optical Society OSA Cartas ópticas , los investigadores informan en detalle cómo se puede utilizar la absorción de tres fotones con microscopía de fluorescencia de lámina de luz para obtener imágenes más profundas en los tejidos. Como demostración, utilizaron la técnica combinada para producir imágenes claras en una bola de células cultivadas, conocida comoun esferoide, de aproximadamente 450 micras de diámetro.
"Esta demostración es muy importante ya que aborda una necesidad insatisfecha de obtener mejores imágenes en profundidad, lo que podría ayudar a los científicos a obtener mejores datos sobre los procesos biológicos", dijo el líder del equipo de investigación, Kishan Dholakia, de la Universidad de St. Andrews en el Reino Unido "Estoel enfoque podría ser especialmente útil para los estudios de neurociencia y biología del desarrollo y podría encontrar aplicación en la obtención de imágenes de múltiples muestras de forma automática para el descubrimiento de fármacos ".
La luz necesaria para obtener imágenes de etiquetas fluorescentes puede ser dañina e incluso mortal para muestras biológicas delicadas como el tejido cerebral o los embriones de animales utilizados para estudiar el desarrollo y los procesos de la enfermedad. La microscopía de fluorescencia de lámina luminosa permite obtener imágenes rápidas de alta resolución con poco daño ópticoporque ilumina una muestra con solo una delgada lámina de luz; otras partes de la muestra no reciben ninguna exposición innecesaria a la luz.
"Esperamos que la microscopía de fluorescencia con láminas de luz de tres fotones tenga un gran impacto en la formación de imágenes del cerebro en roedores como ratones y ratas, donde podría usarse para capturar imágenes de campo muy amplio con resolución subcelular", dijo el documento.primer autor Adrià Escobet-Montalbán.
Imágenes más profundas
Los investigadores querían comparar la microscopía de fluorescencia de láminas de luz de tres fotones con la absorción de dos fotones utilizada anteriormente. En la absorción de múltiples fotones, la etiqueta fluorescente emite luz después de absorber o ser excitada por dos o tres fotones en lugar de unofotón utilizado para producir fluorescencia tradicional.
La absorción multiphoton reduce la luz desenfocada y minimiza la luz que podría dañar la muestra porque usa longitudes de onda más largas, que se dispersan menos por el tejido, y al limitar la luz de excitación a un volumen pequeño. Cuando se utilizan tres fotones para producirfluorescencia en lugar de dos, estos beneficios se amplifican.
Para demostrar su nueva técnica, los investigadores utilizaron una configuración óptica estándar para microscopía de fluorescencia de lámina de luz con un láser pulsado que se usa tradicionalmente para la excitación de dos fotones. Aunque este láser no era el más apropiado para crear una excitación eficiente de tres fotones, fue ideal para comparar la excitación de dos fotones y la de tres fotones.
El equipo de investigación tomó imágenes de esferoides de células de riñón embrionario humano usando excitación de dos fotones y tres fotones. Cerca de la superficie del esferoide, ambas modalidades de imágenes tuvieron un rendimiento similar. Sin embargo, en el extremo más alejado del esferoide, la calidad de imagen para los tresla microscopía de fluorescencia de lámina de fotón preserva el contraste de la imagen, mientras que la calidad de la imagen de dos fotones disminuyó considerablemente.
Optimizando la técnica
Para mejorar aún más la imagen de profundidad y el campo de visión, los investigadores experimentaron con el cambio del perfil de intensidad de luz del láser a un haz de Bessel, que tiene un núcleo central brillante rodeado de anillos concéntricos, en lugar del tradicional haz de láser sólido gaussiano comola de un puntero láser.
"Los haces de Bessel se pueden usar en modo de lámina de luz de dos fotones, pero pueden producir artefactos potenciales debido a sus anillos concéntricos", dijo el coautor Federico Gasparoli. "Por primera vez, mostramos numérica y experimentalmente que estos problemas sonsuprimido en la microscopía de fluorescencia de lámina de luz de tres fotones y que el haz va aún más profundo, lo que hace que este enfoque sea muy atractivo ".
A continuación, los investigadores planean mejorar la técnica mediante el uso de sistemas láser a longitudes de onda más largas que están específicamente diseñados para la absorción de tres fotones. Esto debería permitir obtener imágenes a mayor profundidad. En paralelo, los investigadores están trabajando para desarrollar formas de detectar la luzemitido por etiquetas fluorescentes en el interior de muestras.
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Materiales proporcionados por La sociedad óptica . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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