CRISPR-Cas9 es una herramienta revolucionaria en parte debido a su versatilidad: creada por bacterias para masticar virus, funciona igualmente bien en las células humanas para hacer todo tipo de trucos genéticos, incluyendo cortar y pegar ADN, hacer mutaciones precisas y activaro inactivar un gen.
La Universidad de California, Berkeley, los investigadores ahora lo han hecho aún más versátil al darle un interruptor de "encendido", lo que permite a los usuarios mantener apagado el editor del gen Cas9 en todas las células, excepto en su objetivo designado.
La enzima Cas9 rediseñada, a la que los investigadores se refieren como ProCas9, es completamente funcional, excepto que contiene una longitud de proteína que necesita ser cortada antes de que la enzima pueda unirse y cortar el ADN. Si los científicos insertan una longitud corta de proteína quesolo se puede cortar con una enzima en particular, como una utilizada exclusivamente por células cancerosas o un virus o bacteria infeccioso, esa enzima se convierte en un desencadenante para activar Cas9.
ProCas9 esencialmente "detecta" el tipo de célula en la que se basa basándose en la enzima de corte de proteínas, una llamada proteasa presente.
"Esta es una capa adicional de seguridad que podría poner en la molécula para garantizar un corte preciso", dijo David Savage, profesor asociado de biología molecular y celular de UC Berkeley.
También dota a la proteína Cas9 con entradas programables además de sus salidas programables.
"Hay muchas proteasas que regulan las vías de señalización en las células, transforman las células normales en células cancerosas y están involucradas en la infección por patógenos", dijo Savage. "Si podemos detectar estas señales, podemos aprovechar y responder en consecuencia aestas vías importantes "
En el estudio, Savage y sus colegas demostraron el control de la proteasa de Cas9 haciéndolo sensible tanto a los virus vegetales como a los humanos, como el Virus del Nilo Occidental. En el futuro, creen que este tipo de tecnología podría usarse para importar CRISPR-Sistema inmunitario bacteriano Cas9 en plantas para ayudarles a defenderse de los patógenos virales dañinos.
El estudio realizado por investigadores de UC Berkeley y los Institutos Gladstone en San Francisco se publicará en línea el 10 de enero en la revista Celda .
Despojando Cas9 a lo esencial
El objetivo de investigación original de Savage era reducir la proteína Cas9, las "tijeras" que realmente recortan el ADN para hacer la edición de genes, en sus partes más simples, para obtener el editor de genes más robusto posible. Cuanto más simple es, más fáciles para trabajar y transportar a las celdas.
"Sabemos que las proteínas Cas son complejas y que tienen todo tipo de regulación que es fundamental para su funcionamiento en un sistema inmunitario bacteriano", dijo. "El objetivo general de nuestro trabajo es domesticarlas para su uso en humanosy eliminar las cosas innecesarias que no son relevantes para la edición del genoma "
En particular, quería rediseñar Cas9 para que fuera más fácil unir otras proteínas. Esto permitiría que Cas9 llevara proteínas con una variedad de funciones al lugar correcto en el ADN. Estas se conocen como proteínas de fusión, cuyas variantes prometedoraspuede alterar la expresión génica o, en el caso de una tecnología conocida como edición de bases, alterar una base o nucleótido en el ADN con precisión precisa.
La técnica que utilizó para rediseñar Cas9, llamada permutación circular, nunca se ha probado en una proteína tan compleja como Cas9. La permutación circular implica tomar la cadena de aminoácidos de la proteína Cas9 y cortarla, cambiando el orden de los dos segmentos, y luego permitiendo que se pliegue en una nueva configuración 3D. Hizo esto para todas las formas posibles de cortar la proteína en dos partes.
Si bien podría pensar que esto destruiría completamente la proteína, en aproximadamente el 10 por ciento de los casos, la nueva proteína aún funcionaba, como si simplemente hubiera reorganizado las subunidades de la proteína de una manera diferente que no afectara su funcionamiento. Esto puede funcionarporque, como han demostrado la inventora de CRISPR-Cas9, Jennifer Doudna y sus colegas, el complejo de proteínas Cas9 es muy flexible y se mueve a medida que se agarra al ARN guía, se une al ADN y se posiciona para cortar las cadenas de ADN.
Savage actualmente está explorando algunos reordenamientos de Cas9 que pueden proporcionar un mejor andamio para las proteínas de fusión, acercándolos a la cadena de ADN a la que apuntan.
En el proceso de reorganizar el andamio Cas9, descubrió, por casualidad, que la forma en que reconectaba los dos segmentos de proteínas marcaba la diferencia.
"Cuando cortamos la proteína y trasladamos la pieza vieja a un nuevo lugar dentro de la proteína, el sistema se volvió muy sensible a cómo unías los dos fragmentos", dijo. "Nos dimos cuenta de que podíamos usar esa sensibilidad para diseñarla proteína para tener sitios de reconocimiento de proteasa "
El estudio muestra que "no estamos atascados con lo que la naturaleza nos dio con respecto a las proteínas de edición del genoma", dijo. "Estas proteínas pueden optimizarse y convertirse en andamios que no se encuentran en la naturaleza pero que poseen las propiedades correctas parauso en células humanas "
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de California - Berkeley . Original escrito por Robert Sanders. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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