Una nueva herramienta poderosa está disponible para la investigación de la neurociencia en el desarrollo del cerebro, los mecanismos de memoria y aprendizaje, y el papel de la desregulación cerebral en enfermedades neuropsiquiátricas como la adicción, la depresión, la esquizofrenia y la enfermedad de Alzheimer.
Esta herramienta de biología molecular, desarrollada y validada por investigadores de la Universidad de Alabama en Birmingham, puede activar de forma selectiva y robusta los genes en las neuronas. Se ha entregado a las neuronas que crecen en un plato y, lo que es más importante, tambiénha sido entregado a las neuronas cerebrales en ratas adultas vivas. La herramienta puede aumentar la expresión de un solo gen o la expresión de múltiples genes al mismo tiempo, y la cantidad de aumento de la expresión génica se puede controlar.
Esta capacidad selectiva para aumentar la expresión génica, lo que significa que el gen produce más ARNm que codifica más proteínas, permite a los investigadores consultar el papel de genes individuales o grupos de genes.
Estas consultas son bloques de construcción para aprender cómo la expresión de diferentes programas genéticos durante el desarrollo controla el crecimiento cerebral, el cableado y los tipos de neuronas creadas. Para el cerebro adulto, la herramienta puede ayudar a explicar cómo los programas genéticos alterados por la actividad neuronal y la experiencia conductual conducenal comportamiento adaptativo. La herramienta también puede ayudar a investigar la desregulación de los programas genéticos, muchos de los cuales están implicados en enfermedades neuropsiquiátricas, que ocurren durante el desarrollo del cerebro o en el cerebro adulto completamente desarrollado.
La herramienta utiliza una tecnología bien conocida basada en CRISPR, que se empaquetó en lentivirus para una introducción estable en las neuronas.
"La tecnología basada en CRISPR ha proporcionado nuevas vías para interrogar la función génica, pero las dificultades en la expresión transgénica en las neuronas posmitóticas han retrasado la incorporación de estas herramientas en el sistema nervioso central", dijo Jeremy Day, Ph.D., líder deel equipo de investigación de la UAB. "Aquí, demostramos un sistema de activación transcripcional dual CRISPR dual lentiviral altamente eficiente y optimizado para neuronas capaz de inducción de genes robusta, modular y sintonizable y regulación génica multiplexada en varios sistemas primarios de cultivo de neuronas de roedores".
Day es profesor asistente en el Departamento de Neurobiología, Facultad de Medicina de la UAB, y científico en el Centro de Investigación Internacional Civitan de la UAB. El estudio se publica en la revista eNeuro , con Katherine E. Savell y Svitlana V. Bach, Ph.D., Departamento de Neurobiología de la UAB, como primeros autores.
"Con el desarrollo de la tecnología CRISPR, pudimos editar selectivamente genes y niveles de expresión génica bajo demanda", dijo Erin Calipari, Ph.D., profesora asistente en el Vanderbilt Brain Institute de la Universidad de Vanderbilt, que no participóen el estudio "Esto proporcionó una nueva herramienta poderosa para vincular los efectos de la expresión génica y la regulación génica con la función y el comportamiento celular; pero hasta ahora, estos sistemas estaban optimizados principalmente para su uso en cultivos celulares".
"Si bien suena trivial", dijo Calipari, "llevar una herramienta genética del cultivo al uso in vivo es increíblemente difícil. Esta tecnología va a revolucionar el uso de estos sistemas in vivo para vincular los cambios en los reguladores transcripcionales en determinadosgenes en regiones cerebrales definidas para la actividad y el comportamiento neuronales Además, estas herramientas permitirán la manipulación específica de la región de genes individuales, o grupos de genes, en animales despiertos y en comportamiento, lo que nos dará una visión sin precedentes deel papel de la expresión génica en el comportamiento "
"Entender los mecanismos básicos que rigen este proceso", dijo, "es el primer paso para desarrollar tratamientos selectivos para la enfermedad psiquiátrica".
Detalles del estudio
El sistema CRISPR / Cas9 es ampliamente conocido como tijeras moleculares que pueden cortar en un sitio preciso en el genoma para eliminar un gen o agregar un gen. Una forma inactiva de CRISPR / Cas9 que no puede cortar el ADN puede unirse con transcripcionalefectores para activar la expresión de un gen en una ubicación precisa. Day y sus colegas utilizaron este sistema, llamado CRISPRa. Lo empaquetaron en lentivirus para permitir la expresión estable de la maquinaria CRISPR, permitiendo a los investigadores probar su capacidad para regular genes en neuronas. El sistema incluyeun CRISPR-defectuoso-Cas9 con activadores y una única guía de ARN que guía el CRISPR-dCas9 a un punto preciso en el genoma.
Una limitación del uso de CRISPRa en las neuronas es que los promotores que se usan comúnmente para conducir maquinaria molecular en otros tipos de células fueron ineficaces para impulsar la expresión de CRISPR en las neuronas. Para evitar esto, los investigadores de la UAB seleccionaron un promotor específico de neuronas, basado enLa secuencia promotora del gen Synapsin humano, o SYN, para expresar su herramienta CRISPRa en neuronas.Los investigadores de la UAB desarrollaron ARN de guía única CRISPR para dirigir este sistema a una gama de genes distintos, desde pequeños factores de transcripción hasta proteínas extracelulares grandes.Demostraron que este sistema inducía significativamente la expresión de cada uno de estos objetivos genéticos en las neuronas de ratas primarias de la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado del cerebro.
El uso de múltiples ARN de guía única, llamado multiplexación, permitió la regulación positiva ajustable de genes individuales o la regulación positiva coordinada de múltiples genes.
Los equipos de la UAB también probaron el sistema en un gen cerebral muy complejo, el factor neurotrófico derivado del cerebro o Bdnf. Bdnf es extremadamente difícil de estudiar debido a su compleja regulación transcripcional, sin embargo, es importante por su papel central en diversos procesostales como la diferenciación neuronal y la supervivencia, el crecimiento dendrítico, el desarrollo sináptico, la potenciación a largo plazo y la formación de memoria. Bdnf tiene nueve ubicaciones de promotores diferentes, y cada una conduce a una transcripción de ARNm variante.
"Debido a esta complejidad, los intentos de caracterizar distintos roles funcionales de los ARNm de Bdnf individuales en las neuronas han producido resultados contradictorios, y las herramientas disponibles en la actualidad carecen de la capacidad de regular selectivamente las variantes de transcripción de Bdnf individuales o requieren protocolos de clonación molecular engorrosos para generar genes.construcciones específicas de orientación ", dijo Day.
Day y sus colegas pudieron usar su sistema CRISPR-dCas9 para dirigirse específicamente a promotores individuales en dos sitios diferentes en Bndf. Cada uno indujo solo la transcripción de ese sitio, sin alterar la expresión en ninguno de los otros promotores. Luego caracterizaron la expresión diferencialgenes inducidos corriente abajo por cada transcripción única y cambios acompañantes medidos en la fisiología neuronal.
Finalmente, los investigadores validaron su sistema de regulación génica en ratas adultas, utilizando cirugía estereotáctica para infundir lentivirus portadores de CRISPRa en la corteza prefrontal, el hipocampo y el núcleo accumbens del cerebro.
"Creo que recién estamos comenzando a rascar la superficie de los tipos de regulación génica ahora posibles a través de la generación de herramientas dCas9 acopladas a los efectores como estas", dijo Catherine Jensen Peña, Ph.D., profesora asistente en Princeton NeuroscienceInstitute, que no participó en el estudio "Esto abre posibilidades emocionantes en neurociencia, particularmente para estudiar la complejidad de la función cerebral y los trastornos cerebrales".
El apoyo provino de los Institutos Nacionales de Salud otorga DA039650, DA034681, MH114990, DA042514, MH112304 y DA041778; el Centro de Investigación Internacional Civitan de la UAB; y el Programa de Becarios Pittman de la UAB.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de Alabama en Birmingham . Original escrito por Jeff Hansen. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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