En los últimos seis años, una herramienta llamada CRISPR-Cas9 ha transformado la investigación genética, permitiendo a los científicos cortar y editar hebras de ADN en ubicaciones precisas como un par de tijeras pequeñas.
Pero a veces, se necesita más que unas tijeras para hacer el trabajo. Ahora, un equipo internacional colaborativo ha presentado una nueva herramienta basada en CRISPR que actúa más como una trituradora, capaz de eliminar grandes extensiones de ADN en células humanas con objetivos programables.
Escribiendo en célula molecular describen cómo lograron obtener un tipo diferente de sistema CRISPR-Cas llamado Tipo I CRISPR-Cas3 para que funcione como herramienta de edición de ADN de largo alcance en células humanas por primera vez.
La herramienta resultante proporciona una forma de apuntar y eliminar extensiones de ADN mucho más largas que las herramientas actuales de Cas9. Ese poder podría utilizarse en la investigación genética para comprender los fundamentos de la enfermedad, y potencialmente en el tratamiento de enfermedades ligadas a largo tiempotramos de ADN.
Yan Zhang, Ph.D., el científico de la Universidad de Michigan que dirigió la investigación, explica que la nueva herramienta utiliza un tipo diferente de sistema CRISPR que los que contienen Cas9 ampliamente utilizados. Ambos se toman prestados de bacterias, donde normalmentefunción para encontrar y eliminar el ADN invasor.
Un tipo diferente de CRISPR
La nueva herramienta utiliza un CRISPR Tipo I, que es mucho más común en bacterias que la variedad Tipo II que incluye Cas9. El CRISPR Tipo I nunca se ha utilizado en ninguna célula eucariota, y emplea un complejo de riboproteína conocido como Cascade para buscar suobjetivo y una enzima llamada Cas3 para destruir el ADN.
El lado desafiante de optimización y purificación de proteínas del trabajo se realizó en el laboratorio del profesor de la Universidad de Cornell, Ailong Ke, Ph.D., coautor del artículo. El estudiante graduado de Cornell Adam Dolan y el especialista en investigación senior de la UM Zhonggang Hou, Ph.D. son los primeros autores del artículo.
La investigación incluyó una posibilidad remota de Zhang, que estudió CRISPR-Cas9 bacteriano y desarrolló herramientas para editar material genético en células humanas, y Ke, que estudió CRISPR Tipo I utilizando enfoques estructurales y bioquímicos.
Se propusieron tratar de entregar los componentes bacterianos CRISPR como proteínas en las células madre embrionarias humanas y en otro tipo de célula llamada HAP1. Con una guía CRISPR, el equipo logró eliminar porciones de ADN objetivo que van desde unos pocos cientos de pares de basesa 100 kilobases.
una trituradora motorizada
Zhang llama al sistema Cascade-Cas3 una "trituradora de ADN con un motor" porque puede moverse a lo largo de un genoma de ADN por una cierta distancia, rompiendo el material genético a medida que avanza.
"Cas9 es una tijera molecular que va a donde la quieres y corta una vez", dice Zhang, profesor asistente de química biológica en la Facultad de Medicina de la UM. "Pero Cas3 va a donde la quieres, viaja a lo largo del cromosoma y produceun espectro de deleciones de decenas de kilobases de largo. Esto podría convertirlo en una poderosa herramienta de detección para determinar qué áreas grandes de ADN son más importantes para una enfermedad en particular ".
Esto podría ser especialmente útil cuando los científicos estudian los tramos largos de ADN "no codificantes" que no contienen el código para una proteína en particular; la técnica de "trituradora" podría permitirles demoler una secuencia de tramos largos y verlo que pasa.
Además, la capacidad de Cas3 para viajar en el cromosoma a larga distancia no se puede hacer con ninguna técnica actual de Cas9. Por lo tanto, una versión de Cas3 "nucleasa muerta" que puede viajar a lo largo del ADN pero carece de la función de trituradora podría proporcionaruna potente plataforma de entrega para la ingeniería de epigenomas de largo alcance.
desafíos científicos
Parte del esfuerzo de investigación consistió en descubrir cómo hacer que las células madre humanas revelaran si se había eliminado algún ADN, ya que la mayoría de las líneas de "reportero" de células madre desarrolladas para la investigación con CRISPR-Cas9 no son lo suficientemente sensibles si la trituraciónla actividad es baja. Sara Howden, Ph.D. de la Universidad de Melbourne, Australia, trabajó en la construcción de una línea celular sensible de doble reportero.
Otro desafío para el equipo fue descubrir qué había triturado la trituradora después de que se realizó la escritura, utilizando la secuenciación de ADN de próxima generación y yendo más allá de los métodos existentes para ver las pequeñas ediciones que produce Cas9.
Hou desarrolló un método de perfilado basado en transposasa, y Peter Freddolino, Ph.D., profesor asistente de química biológica y medicina computacional y bioinformática en la UM, construyó ductos informáticos personalizados para analizar los resultados de la secuenciación profunda.
Ke también señala en el documento que debido a que la secuencia de ARN guía necesitaba decirle a la "trituradora" a dónde ir es más larga que las secuencias utilizadas en los sistemas CRISPR-Cas9, y también porque la búsqueda y degradación de objetivos son dos pasos bien separados,el nuevo método está potencialmente mejor controlado. Puede ser menos probable que haga cortes erróneos donde no se desean.
Esta nueva herramienta y sus derivados podrían ser útiles para fines terapéuticos, especula Zhang, aunque tal uso es años en el futuro.
Se han informado algunos usos terapéuticos basados en CRISPR-Cas9, incluida una edición controvertida de un gen receptor que permite que el VIH ingrese a las células en los embriones de dos bebés que, según los informes, nacieron en China. Pero le preocupa que CRISPR-Cas9 realice ediciones no deseadasen áreas normales del ADN de pacientes humanos también ha surgido. Se necesitará más trabajo para ver si el enfoque "triturador" evita este problema.
UM y Cornell han solicitado una patente conjunta sobre esta nueva herramienta. La investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud GM128637, GM118174, GM102543 y GM117268 y por la financiación de Zhang del Programa de Becarios de Ciencias Biológicas de la Facultad de Medicina.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Medicina de Michigan - Universidad de Michigan . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
Referencia del diario :
Cita esta página :