El descubrimiento de los primeros inhibidores de molécula pequeña de la proteína St9 de Streptococcus pyogenes Cas9 SpCas9 podría permitir un control más preciso sobre la edición del genoma basada en CRISPR-Cas9, los investigadores informan el 2 de mayo en la revista Celda .
Al desarrollar un conjunto de ensayos bioquímicos y basados en células de alto rendimiento, los investigadores examinaron una colección diversa de moléculas pequeñas para identificar compuestos que interrumpen la unión de SpCas9 al ADN y, por lo tanto, interfieren con su capacidad para cortar el ADN. Estos primeros pequeñosinhibidores de la molécula CRISPR-Cas9 entran fácilmente en las células y son mucho más pequeños que las proteínas anti-CRISPR descubiertas previamente. Los nuevos compuestos permiten un control reversible y dependiente de la dosis de las tecnologías basadas en SpCas9, incluidas sus aplicaciones para la edición de genes, edición de bases yedición epigenética en células de mamíferos.
"Estos estudios sientan las bases para la identificación rápida y el uso de inhibidores de moléculas pequeñas contra SpCas9 y las nucleasas asociadas a CRISPR de próxima generación", dice el autor principal Amit Choudhary del Broad Institute, Harvard Medical School, y Brigham and Women'sHospital. "Los inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen a las nucleasas asociadas a CRISPR tienen el potencial de un uso generalizado en investigación básica, biomédica y de defensa, así como en aplicaciones biotecnológicas".
Actualmente, SpCas9 se está desarrollando como un agente de terapia génica para múltiples afecciones, incluidos VIH, trastornos de la visión, distrofia muscular y otros trastornos hereditarios. Pero estas aplicaciones terapéuticas se beneficiarían enormemente del control preciso sobre la dosis y el momento de la actividad de SpCas9 parareducir los efectos fuera del objetivo. Controlar estos aspectos de la actividad de SpCas9 también podría beneficiar a otras aplicaciones, como editar de manera eficiente el ADN de organismos modelo para modelar y estudiar enfermedades, y el uso de impulsos genéticos en mosquitos genéticamente modificados para reducir la propagación demalaria y otras enfermedades transmitidas por mosquitos.
La necesidad de dosis y control temporal de SpCas9 ha creado una demanda de moléculas anti-CRISPR. Aunque existen proteínas anti-CRISPR que se dirigen a SpCas9, son grandes e impermeables a las células, irreversibles en acción, pueden ser masticadas por proteasas,y pueden presentar el riesgo de reacciones inmunes adversas en el cuerpo. Por el contrario, los inhibidores de moléculas pequeñas son proteolíticamente estables, reversibles y generalmente no inmunogénicos y pueden administrarse fácilmente a las células mediante difusión pasiva. Además, se pueden sintetizar ena gran escala a bajo costo con poca variabilidad de lote a lote.
En el nuevo estudio, Choudhary y su equipo introdujeron una plataforma robusta, sensible y escalable para la identificación y validación rápida y rentable de inhibidores de moléculas pequeñas de SpCas9. Medición de la actividad CRISPR-Cas9 de una manera de alto rendimiento quepermitiría la detección de drogas ha sido un desafío debido a las propiedades de la enzima SpCas9. En el nuevo artículo, Choudhary y sus colegas desarrollaron ensayos primarios y secundarios de alto rendimiento para la unión de ADN SpCas9 y la actividad de corte de ADN SpCas9, respectivamente.En el ensayo, utilizaron una técnica bioquímica llamada polarización de fluorescencia para controlar la interacción entre SpCas9 y un segmento de ADN marcado con fluoróforo que contiene secuencias PAM. En el ensayo secundario, utilizaron microscopía automática para medir los cambios de fluorescencia inducidos por la escisión de ADN mediada por SpCas9 de un reporterogen en las células.
Utilizando estos ensayos, los investigadores primero seleccionaron miembros representativos de múltiples clases de moléculas pequeñas para identificar la clase cuyos miembros frecuentemente inhibían SpCas9. El equipo identificó dos compuestos principales que interrumpen la capacidad de SpCas9 para unir ADN e inhibir la escisión de ADN mediada por SpCas9de manera dependiente de la dosis en células de mamíferos. Dado que bloquean la unión del ADN por la enzima, estas moléculas también inhiben las tecnologías catalíticamente deterioradas de SpCas9, incluidas las de activación transcripcional, y son estables en el plasma humano.
"Estos resultados sientan las bases para un control químico preciso sobre las actividades de CRISPR-Cas9, permitiendo el uso seguro de tales tecnologías", dice Choudhary. "Sin embargo, estas moléculas no están listas para aplicaciones en humanos y no están probadas para determinar su eficacia en organismos."
En futuros estudios, los investigadores planean identificar los sitios de unión de los inhibidores en el complejo SpCas9: gRNA, examinar su mecanismo de acción y optimizar su potencia. También determinarán si las moléculas interactúan con otros objetivos en las células de mamíferos, yevaluar su especificidad hacia otras nucleasas asociadas a CRISPR. Resultados iniciales incluidos en el Celda el documento indica que las moléculas son bastante específicas para su objetivo, ya que no tienen efecto sobre una enzima CRISPR relacionada de forma distante, Cas12a.
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