El etiquetado de espín dirigido al sitio SDSL utilizado en combinación con la espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica EPR ha sido una técnica probada y confiable para dilucidar la estructura, función y dinámica de proteínas y complejos de proteínas. Los marcadores de espín basados en nitróxido se encuentran entre loslos más populares y mejor establecidos porque son pequeños, no molestos y exhiben excelentes propiedades espectroscópicas. "Los procedimientos de etiquetado de giro ideales exhiben altas velocidades de reacción y selectividad", explica el profesor Malte Drescher, profesor de espectroscopia de sistemas complejos en el departamento de la Universidad de Konstanzde Química y autor principal del estudio junto con el profesor Valentin Wittmann, que se especializa en síntesis orgánica.
"Lograr alta reactividad y alta selectividad al mismo tiempo puede ser un problema", continúa Drescher. "Las etiquetas de giro convencionales basadas, por ejemplo, en gadolinio III o tritilo, muestran espectros muy amplios y bajas profundidades de modulación oespectros muy estrechos que no son adecuados para el tipo de experimentos que queremos realizar ". Un nuevo estudio publicado por Drescher, Wittmann y su equipo de químicos de la Universidad de Konstanz, que se publicó en línea en la revista Comunicaciones de ChemBioChem el 14 de agosto de 2019, presenta un nuevo enfoque para etiquetar proteínas que presenta etiquetas de giro basadas en nitróxido y aminoácidos no canónicos codificados genéticamente ncAA como objetivos para SDSL.
"Los nitróxidos proporcionan un ancho espectral ideal y acceso a información dinámica", dice Anandi Kugele, investigadora doctoral de la Escuela de Investigación de Konstanz en Biología Química KoRS-CB y primera autora del estudio, que recibió una beca de viaje de la National HighMagnetic Field Laboratory presentará los resultados en la Conferencia de las Montañas Rocosas sobre Resonancia Magnética de 2019 en Denver, Colorado EE. UU.. "Las etiquetas tradicionales a base de nitróxido tienen una estabilidad redox limitada, lo cual es un inconveniente para las aplicaciones dentro de la celda. El desafío para nosotros fuepara aumentar la estabilidad del nitróxido y, por lo tanto, adaptar las etiquetas de giro basadas en nitróxido para el uso rutinario in vivo futuro ". Con ese fin, los investigadores desarrollaron una nueva etiqueta de giro que se puede unir a proteínas mediante Diels-Alder DAinv cicloadición a ncAA codificados genéticamente, un método que ha demostrado ser adecuado para una amplia gama de aplicaciones in vitro e in vivo. Para lograr la estabilidad del nitróxido, los investigadores utilizaron además una protecciónestrategia basada en grupos protectores fotoremovibles, que se sabe que protegen los nitróxidos y los liberan según sea necesario.
La nueva etiqueta de giro, denominada nitróxido fotoactivable para la reacción DAinv, o PaNDA para abreviar, es soluble en agua, activa en EPR y eficaz en la desprotección tanto en pruebas in vitro como en lisado con las dos proteínas modelo proteína verde fluorescente GFP y Escherichia coli oxidorreductasa tiorredoxina TRX, que se encuentra en prácticamente todos los organismos conocidos, sugieren. "Necesitamos mejorar el método utilizado para entregar la etiqueta de giro de PaNDA a las células y probar las eficiencias de etiquetado y desprotección dentro de la célula,entre otras cosas ", concluye Malte Drescher:" Pero nuestra investigación demuestra claramente que, en principio, la etiqueta PaNDA puede usarse para mediciones de EPR en entornos biológicos desafiantes, incluido el interior de las células. Nuestras pruebas con lisado de E. coli son muy prometedorasen este sentido. Esto abrirá una nueva gama de oportunidades para el estudio de proteínas mediante espectroscopía EPR ".
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Materiales proporcionados por Universidad de Konstanz . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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