Los ingenieros biomédicos de la Universidad de Duke han utilizado una tecnología CRISPR previamente inexplorada para regular y editar con precisión genomas en células humanas.
Con este nuevo enfoque, los investigadores esperan expandir drásticamente las herramientas basadas en CRISPR disponibles para los ingenieros biomédicos, abriendo una nueva y diversa frontera de las tecnologías de ingeniería del genoma.
En un estudio que apareció el 23 de septiembre Biotecnología de la naturaleza Charles Gersbach, profesor asociado de ingeniería biomédica de la familia Rooney en Duke, y Adrian Oliver, un becario postdoctoral en el laboratorio de Gersbach que dirigió el proyecto, describen cómo aprovecharon con éxito los sistemas CRISPR de Clase 1 para activar y activar genes objetivoapagado y edite el epigenoma en las células humanas por primera vez.
CRISPR-Cas es un sistema de defensa en el que las bacterias usan moléculas de ARN y proteínas asociadas a CRISPR Cas para atacar y destruir el ADN de los virus invasores. El descubrimiento de este fenómeno y la reutilización de la maquinaria molecular desencadenó un genoma.revolución de edición a medida que los investigadores aprendieron a manejar la herramienta para apuntar específicamente y editar ADN en células humanas
CRISPR-Cas9, la herramienta de edición de genoma más utilizada en la actualidad, se clasifica como un sistema CRISPR de Clase 2. Los sistemas de Clase 2 son menos comunes en el mundo bacteriano, pero en teoría son más fáciles de trabajar, ya que dependen de uno soloProteína Cas para apuntar y escindir el ADN.
Los sistemas de Clase 1 no son tan simples, ya que dependen de múltiples proteínas que trabajan juntas en un complejo llamado Cascade complejo asociado a CRISPR para la defensa antiviral para atacar el ADN. Después de la unión, Cascade recluta una proteína Cas3 que corta el ADN.
"Si observara los sistemas CRISPR individuales de todas las bacterias en el mundo, casi el 90 por ciento son sistemas de Clase 1", dijo Gersbach. "La biología CRISPR-Cas es una fuente increíble de herramientas de biotecnología, pero hasta hace poco todossolo ha estado mirando una pequeña porción del pastel "
Para demostrar las capacidades del sistema de Clase 1, Oliver conectó activadores de genes a sitios específicos a lo largo de un complejo Cascade de E. coli tipo I y apuntó al sistema para unir promotores de genes, que regulan los niveles de expresión de genes. Debido a que no incluyó el Cas3proteína en el experimento, no hubo corte del ADN ni cambio en la secuencia de ADN subyacente. El experimento mostró que el activador Cascade no solo se une al sitio correcto y puede aumentar los niveles del gen objetivo, sino que lo hace con precisióny especificidad comparable a CRISPR / Cas9.
Oliver repitió el proceso usando complejos de Cascada tipo I de una cepa bacteriana adicional que fue particularmente robusta en el trabajo en una variedad de sitios objetivo. También demostró que el dominio activador podía cambiarse por un represor para desactivar los genes objetivo. Nuevamente,los investigadores notaron precisión y especificidad comparables a los métodos CRISPR / Cas9.
"Hemos encontrado que la estructura de Cascade es notablemente modular, permitiendo que una variedad de sitios conecten activadores o represores, que son excelentes herramientas para alterar la expresión génica en las células humanas", dijo Oliver. "La naturaleza flexible de Cascade lo convierte en unprometedora tecnología de ingeniería del genoma "
Gersbach y Oliver fueron alentados a investigar los sistemas CRISPR Clase 1 más complicados por sus colaboradores en la cercana Universidad Estatal de Carolina del Norte, los profesores Rodolphe Barrangou y Chase Beisel, quien ahora se encuentra en el Centro Helmholtz de Investigación de Infecciones en Alemania. Barrangou es un microbiólogoquien ha estudiado la biología natural de diversos mecanismos de defensa CRISPR durante casi dos décadas, y Beisel es un ingeniero químico que ha trabajado con Barrangou en la ingeniería de microorganismos con sistemas CRISPR de Clase 1. Ambos tenían curiosidad por saber si el laboratorio de Gersbach podría usar estos sistemas en células humanassimilar a su trabajo con Cas9.
"Este trabajo y las tecnologías resultantes son un ejemplo fantástico de cómo la colaboración entre disciplinas y universidades en el Triángulo de Investigación de Carolina del Norte puede ser altamente innovadora y productiva", dice Barrangou, el Profesor Distinguido Todd R. Klaenhammer en Investigación de Probióticos en Carolina del NorteUniversidad Estatal.
Ahora, el equipo es optimista de que su estudio, y el trabajo relacionado de otros en el campo, incentivará una nueva investigación en los sistemas CRISPR de Clase 1.
"El propósito de este proyecto era explorar la diversidad de los sistemas CRISPR", dijo Gersbach. "Ha habido miles de documentos sobre CRISPR-Cas9 en la última década y, sin embargo, constantemente estamos aprendiendo cosas nuevas al respecto. Conen este estudio estamos aplicando esa mentalidad al otro 90% de lo que existe "
Hasta ahora, el equipo ha demostrado que estos sistemas de Clase 1 son comparables a CRISPR-Cas9 en términos de precisión y aplicación. Al considerar direcciones futuras, tienen curiosidad por explorar cómo estos sistemas difieren de sus contrapartes de Clase 2, ycómo estas diferencias podrían resultar útiles para aplicaciones de biotecnología.
El equipo también está interesado en estudiar cómo los sistemas de Clase 1 podrían abordar los desafíos generales para la investigación CRISPR-Cas, especialmente los problemas que complican las posibles aplicaciones terapéuticas, como las respuestas inmunes a las proteínas Cas y el uso simultáneo de múltiples tipos de CRISPR para diferentes funciones de ingeniería del genoma.
"Sabemos que CRISPR podría tener un gran impacto en la salud humana", dijo Gersbach. "Pero todavía estamos al principio de entender cómo se utilizará CRISPR, qué puede hacer y qué sistemas están disponibles paranosotros. Esperamos que esta nueva herramienta permita nuevas áreas de ingeniería del genoma ".
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Materiales proporcionados por Universidad de Duke . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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