El sistema CRISPR es una herramienta poderosa para la edición dirigida de genomas, con un potencial terapéutico significativo, pero corre el riesgo de editar sitios "fuera del objetivo" de manera inapropiada. Sin embargo, un nuevo estudio publicado el 9 de julio de 2020 en el acceso abiertodiario PLOS Biología por Feng Gu de la Universidad Médica de Wenzhou, China, y sus colegas, muestra que la mutación de la enzima en el corazón del sistema de edición de genes CRISPR puede mejorar su fidelidad. Los resultados pueden proporcionar una estrategia terapéuticamente más segura para la edición de genes que el uso de la enzima no modificadasistema.
El sistema CRISPR emplea una enzima llamada Cas9 para escindir el ADN. Cas9 cortará casi cualquier secuencia de ADN. Su especificidad proviene de su interacción con un "ARN guía" gRNA cuya secuencia le permite unirse con el ADN objetivo a través de bases.emparejamiento de pares. Una vez que lo hace, se activa la enzima y se corta el ADN.
El sistema CRISPR se encuentra en múltiples especies bacterianas; entre las que se usan comúnmente en la investigación, la de Staphylococcus aureus tiene la ventaja del tamaño; a diferencia de otras, su gen es lo suficientemente pequeño como para caber dentro de un vector de terapia génica versátil e inofensivo llamadovirus adenoasociado, lo que lo hace atractivo para fines terapéuticos.
Una limitación clave de cualquiera de los sistemas CRISPR, incluido el de S. aureus, es la escisión del ADN fuera del objetivo. Un ARN guía puede unirse débilmente a un sitio cuya secuencia sea una coincidencia cercana pero imperfecta; dependiendo de qué tan cercacoincidencia y cuán estrechamente interactúa la enzima con el complejo de ADNg-ARN emparejado, la enzima puede activarse y cortar el ADN incorrectamente, con consecuencias potencialmente dañinas.
Para explorar si el S. aureus Cas9 podría modificarse para escindirse con mayor fidelidad al objetivo previsto, los autores generaron una gama de mutantes Cas9 novedosos y probaron su capacidad para discriminar contra coincidencias imperfectas manteniendo una alta actividad en el sitio previsto.Encontraron uno de esos mutantes, que distinguía y rechazaba los desajustes de pares de bases únicos entre el ARNg y el ADN, independientemente del objetivo, lo que aumentaba la fidelidad hasta 93 veces con respecto a la enzima original. Demostraron que la mutación afectaba parte del dominio de reconocimiento,la región de la enzima que coordina los contactos entre la enzima y el complejo gRNA-DNA. La mutación tuvo el efecto probable de debilitar esos contactos, asegurando así que solo el emparejamiento más fuerte, que vendría de una secuencia de coincidencia perfecta, desencadenaríaactividad enzimática.
"Evitar la división fuera del objetivo es un desafío crucial para el desarrollo de CRISPR para intervenciones médicas, como corregir enfermedades genéticas o atacar células cancerosas", dijo Gu. "Nuestros resultados señalan el camino para desarrollar estrategias de terapia génica potencialmente más seguras".
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Materiales proporcionados por PLOS . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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