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Muévase CRISPR, vienen los Retrons

La nueva técnica de edición de genes permite realizar millones de experimentos genéticos simultáneamente

Fecha :
30 de abril de 2021
Fuente :
Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard
Resumen :
Los investigadores han creado una nueva herramienta de edición de genes llamada Retron Library Recombineering RLR que puede generar hasta millones de mutaciones simultáneamente, y 'códigos de barras' de células bacterianas mutantes para que todo el grupo se pueda analizar a la vez. Se puede utilizar encontextos donde CRISPR es tóxico o no es factible, y da como resultado mejores tasas de edición.
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Los investigadores han creado una nueva herramienta de edición de genes llamada Retron Library Recombineering RLR que puede generar hasta millones de mutaciones simultáneamente, y 'códigos de barras' de células bacterianas mutantes para que todo el grupo se pueda analizar a la vez. Se puede utilizar encontextos donde CRISPR es tóxico o no es factible, y da como resultado mejores tasas de edición.

Si bien el sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 se ha convertido en el modelo de referencia de la innovación en biología sintética, tiene algunas limitaciones importantes. CRISPR-Cas9 se puede programar para encontrar y cortar piezas específicas de ADN, pero editar el ADN para crear las mutaciones deseadasrequiere engañar a la célula para que use una nueva pieza de ADN para reparar la ruptura. Este cebo y cambio puede ser complicado de orquestar, e incluso puede ser tóxico para las células porque Cas9 a menudo también corta sitios no deseados fuera del objetivo.

Las técnicas alternativas de edición de genes llamadas recombinantes en su lugar realizan este cebo y cambio introduciendo una pieza alternativa de ADN mientras una célula está replicando su genoma, creando de manera eficiente mutaciones genéticas sin romper el ADN. Estos métodos son lo suficientemente simples como para que se puedan usar enmuchas células a la vez para crear conjuntos complejos de mutaciones para que los investigadores las estudien. Sin embargo, averiguar cuáles son los efectos de esas mutaciones requiere que cada mutante sea aislado, secuenciado y caracterizado: una tarea que requiere mucho tiempo y es poco práctica.

Investigadores del Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard y la Escuela de Medicina de Harvard HMS han creado una nueva herramienta de edición de genes llamada Retron Library Recombineering RLR que facilita esta tarea. RLR genera hasta millones de mutaciones simultáneamente,y células mutantes con "códigos de barras" para que todo el conjunto se pueda examinar a la vez, lo que permite generar y analizar fácilmente cantidades masivas de datos. El logro, que se ha logrado en células bacterianas, se describe en un artículo reciente en PNAS .

"RLR nos permitió hacer algo que es imposible de hacer con CRISPR: cortamos aleatoriamente un genoma bacteriano, convertimos esos fragmentos genéticos en ADN monocatenario in situ y los usamos para analizar millones de secuencias simultáneamente", dijo el co-El primer autor Max Schubert, Ph.D., un postdoctorado en el laboratorio de George Church, Ph.D., miembro de la Facultad de Wyss Core. "RLR es una herramienta de edición de genes más simple y flexible que se puede usar para experimentos altamente multiplexados, lo que elimina latoxicidad que a menudo se observa con CRISPR y mejora la capacidad de los investigadores para explorar mutaciones a nivel del genoma ".

Retrons: de enigma a herramienta de ingeniería

Los retrones son segmentos de ADN bacteriano que se someten a transcripción inversa para producir fragmentos de ADN monocatenario ssDNA. La existencia de los retrones se conoce desde hace décadas, pero la función del ssDNA que producen a científicos desconcertados desde la década de 1980 hasta junio de 2020,cuando un equipo finalmente descubrió que retron ssDNA detecta si un virus ha infectado la célula, formando parte del sistema inmunológico bacteriano.

Si bien los retrones originalmente se consideraban simplemente una misteriosa peculiaridad de las bacterias, los investigadores se han interesado más en ellos en los últimos años porque, como CRISPR, podrían usarse para la edición de genes precisa y flexible en bacterias, levaduras e incluso humanos.células.

"Durante mucho tiempo, CRISPR se consideró algo extraño que hacían las bacterias, y descubrir cómo aprovecharlo para la ingeniería del genoma cambió el mundo. Los retrones son otra innovación bacteriana que también podría proporcionar algunos avances importantes", dijo Schubert.Su interés en los retrones se despertó hace varios años debido a su capacidad para producir ssDNA en bacterias, una característica atractiva para su uso en un proceso de edición de genes llamado recombineering de oligonucleótidos.

Las técnicas de edición de genes basadas en la recombinación requieren la integración del ssDNA que contiene una mutación deseada en el ADN de un organismo, lo cual se puede hacer de dos maneras. El ADN bicatenario se puede cortar físicamente con CRISPR-Cas9, por ejemplo para inducir lacelular para incorporar la secuencia mutante en su genoma durante el proceso de reparación, o la hebra de ADN mutante y una proteína de hibridación monocatenaria SSAP se pueden introducir en una célula que se está replicando para que SSAP incorpore la hebra mutante en las células hijas'ADN.

"Pensamos que los retrones deberían darnos la capacidad de producir ssDNA dentro de las células que queremos editar en lugar de intentar forzarlos a entrar en la célula desde el exterior y sin dañar el ADN nativo, que eran cualidades muy convincentes".dijo el co-primer autor Daniel Goodman, Ph.D., ex becario de investigación de posgrado en el Instituto Wyss que ahora es becario posdoctoral de Jane Coffin Childs en UCSF.

Otro atractivo de los retrones es que sus propias secuencias pueden servir como "códigos de barras" que identifican qué individuos dentro de un grupo de bacterias han recibido cada secuencia de retrones, lo que permite pantallas agrupadas dramáticamente más rápidas de cepas mutantes creadas con precisión.

Para ver si realmente podían usar retrones para lograr una recombinación eficiente con retrones, Schubert y sus colegas primero crearon plásmidos circulares de ADN bacteriano que contenían genes de resistencia a antibióticos colocados dentro de secuencias de retrones, así como un gen SSAP para permitir la integración de los retrones.secuencia en el genoma bacteriano. Insertaron estos plásmidos retron en bacterias E. coli para ver si los genes se integraron con éxito en sus genomas después de 20 generaciones de replicación celular. Inicialmente, menos del 0,1% de E. coli que lleva el sistema de recombinación retron incorporóla mutación deseada.

Para mejorar este decepcionante rendimiento inicial, el equipo hizo varios ajustes genéticos a las bacterias. Primero, inactivaron la maquinaria de reparación de desajustes naturales de las células, que corrige los errores de replicación del ADN y, por lo tanto, podría estar "arreglando" las mutaciones deseadas antes de que pudieranpara pasar a la siguiente generación. También inactivaron dos genes bacterianos que codifican exonucleasas, enzimas que destruyen el ssDNA flotante. Estos cambios aumentaron drásticamente la proporción de bacterias que incorporaron la secuencia de retron, a más del 90% de lapoblación.

Etiquetas de nombre para mutantes

Ahora que estaban seguros de que su ADNss retron se había incorporado en los genomas de sus bacterias, el equipo probó si podían usar los retron como un "atajo" de secuenciación genética, lo que permitió realizar muchos experimentos en una mezcla. Porque cada plásmido tenía supropia secuencia de retron única que puede funcionar como una "etiqueta de nombre", razonaron que deberían poder secuenciar el retron mucho más corto en lugar de todo el genoma bacteriano para determinar qué mutación habían recibido las células.

En primer lugar, el equipo probó si RLR podía detectar mutaciones conocidas de resistencia a antibióticos en E. coli. Descubrieron que sí: las secuencias de retroceso que contenían estas mutaciones estaban presentes en proporciones mucho mayores en sus datos de secuenciación en comparación con otras mutaciones. El equipo también determinóque RLR era lo suficientemente sensible y preciso como para medir pequeñas diferencias en la resistencia que resultan de mutaciones muy similares. Lo que es crucial, recopilar estos datos secuenciando códigos de barras de todo el grupo de bacterias en lugar de aislar y secuenciar mutantes individuales, acelera drásticamente el proceso.

Luego, los investigadores llevaron el RLR un paso más allá para ver si podía usarse en ADN fragmentado aleatoriamente y averiguar cuántos retrones podían usar a la vez. Cortaron el genoma de una cepa de E. coli altamente resistentea otro antibiótico, y usó esos fragmentos para construir una biblioteca de decenas de millones de secuencias genéticas contenidas dentro de secuencias de retrones en plásmidos. "La simplicidad de RLR realmente brilló en este experimento, porque nos permitió construir una biblioteca mucho más grande que la queactualmente se puede usar con CRISPR, en el que tenemos que sintetizar tanto una guía como una secuencia de ADN del donante para inducir cada mutación ", dijo Schubert.

Esta biblioteca se introdujo luego en la cepa de E. coli optimizada para RLR para su análisis. Una vez más, los investigadores encontraron que los retrones que confieren resistencia a los antibióticos se podían identificar fácilmente por el hecho de que estaban enriquecidos con respecto a otros cuando se secuenciaba el grupo de bacterias.

"Ser capaz de analizar bibliotecas de mutantes con códigos de barras agrupadas con RLR permite realizar millones de experimentos simultáneamente, lo que nos permite observar los efectos de las mutaciones en todo el genoma, así como cómo esas mutaciones podrían interactuar entre sí", dijo el seniorEl autor George Church, quien dirige el Área de Enfoque de Biología Sintética del Instituto Wyss y también es Profesor de Genética en HMS. "Este trabajo ayuda a establecer una hoja de ruta hacia el uso de RLR en otros sistemas genéticos, lo que abre muchas posibilidades interesantes para la investigación genética futura."

Otra característica que distingue a RLR de CRISPR es que la proporción de bacterias que integran con éxito una mutación deseada en su genoma aumenta con el tiempo a medida que las bacterias se replican, mientras que el método "one shot" de CRISPR tiende a tener éxito o fallar en el primer intento.RLR podría potencialmente combinarse con CRISPR para mejorar su rendimiento de edición, o podría usarse como una alternativa en los muchos sistemas en los que CRISPR es tóxico.

Queda más trabajo por hacer en RLR para mejorar y estandarizar la velocidad de edición, pero crece el entusiasmo por esta nueva herramienta. La naturaleza simple y optimizada de RLR podría permitir el estudio de cómo interactúan múltiples mutaciones entre sí y la generación de una grannúmero de puntos de datos que podrían permitir el uso del aprendizaje automático para predecir más efectos mutacionales.

"Esta nueva herramienta de biología sintética lleva la ingeniería del genoma a niveles aún más altos de rendimiento, lo que sin duda conducirá a innovaciones nuevas, emocionantes e inesperadas", dijo Don Ingber, MD, Ph.D., director fundador del Wyss Institute.Ingber también es profesor Judah Folkman de biología vascular en el HMS y el Boston Children's Hospital, y profesor de bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.

Los autores adicionales del artículo incluyen a Timothy Wannier de HMS, Divjot Kaur de la Universidad de Warwick, Fahim Farzadfard y Timothy Lu del Instituto de Tecnología de Massachusetts, y Seth Shipman del Instituto Gladstone de Ciencia de Datos y Biotecnología.

Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Energía de los Estados Unidos DE-FG02-02ER63445 y por la Beca de Posgrado en Ciencias e Ingeniería de la Defensa Nacional.


Fuente de la historia :

Materiales proporcionado por Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard . Original escrito por Lindsay Brownell. Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.


Referencia de la revista :

  1. Max G. Schubert, Daniel B. Goodman, Timothy M. Wannier, Divjot Kaur, Fahim Farzadfard, Timothy K. Lu, Seth L. Shipman, George M. Church. pantallas de variantes funcionales de alto rendimiento a través de la producción in vivo de ADN monocatenario . Actas de la Academia Nacional de Ciencias , 2021; 118 18: e2018181118 DOI: 10.1073 / pnas.2018181118

cite esta página :

Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard. "Muévase sobre CRISPR, vienen los Retrons: la nueva técnica de edición de genes permite realizar millones de experimentos genéticos simultáneamente". ScienceDaily. ScienceDaily, 30 de abril de 2021. .
Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard. 2021, 30 de abril. Muévase sobre CRISPR, vienen los Retrons: la nueva técnica de edición de genes permite que millones de experimentos genéticos se realicen simultáneamente. ScienceDaily . Consultado el 30 de abril de 2021 en www.science-things.com/releases/2021/04/210430120411.htm
Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica en Harvard. "Muévase por encima de CRISPR, vienen los Retrons: la nueva técnica de edición de genes permite realizar millones de experimentos genéticos simultáneamente". ScienceDaily. Www.science-things.com/releases/2021/04 / 210430120411.htm consultado el 30 de abril de 2021.

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