Investigadores del Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN en Japón han desarrollado un nuevo sistema para obtener imágenes de la actividad de las neuronas individuales en el cerebro del tití. Publicado en Informes de celda , el estudio muestra cómo amplificar las señales fluorescentes codificadas genéticamente con la expresión de genes inducibles por TET permite obtener imágenes de cientos de neuronas individuales en el cerebro de los primates simultáneamente durante un período de varios meses.
Los científicos que desean estudiar la actividad neuronal relacionada con comportamientos cognitivos y sociales complicados han tenido un éxito limitado al usar la microscopía de dos fotones en cerebros de primates. Como parte de la nueva iniciativa de Mapeo del cerebro de Japón por Neurotecnologías innovadoras para estudios de enfermedades Cerebro / MINDS, los investigadoresliderados por Tetsuo Yamamori y Masanori Matsuzaki han utilizado el tití, un mono pequeño pero inteligente y socialmente complejo, para superar las limitaciones del pasado.
"La simple adopción de la misma técnica utilizada en ratones no funcionó en absoluto porque la señal fluorescente era demasiado débil", explica el autor principal Osamu Sadakane. "Pero, al mejorar la técnica viral, amplificamos la señal y logramos observar una señal grandegrupo de neuronas en la neocorteza tití ".
La microscopía de dos fotones es una técnica utilizada para obtener imágenes de las células vivas por excitantes compuestos fluorescentes, llamados fluoróforos, con láseres que emiten luz infrarroja. Cuando los fotóforos golpean los fluoróforos simultáneamente, emiten una señal fluorescente. Debido a que las neuronas usan calcio.cuando transmiten señales, la actividad neuronal puede visualizarse mediante la unión genética de fluoróforos a los indicadores de calcio, moléculas que se unen al calcio. Hasta ahora, el uso de estos indicadores de calcio codificados genéticamente, o GECI, ha tenido éxito en animales pequeños como ratones,pero ha sido limitado en los primates porque los niveles de expresión débiles produjeron señales fluorescentes que eran demasiado débiles para ser vistas.
El equipo tuvo éxito en los titíes modificando cómo se producía GCaMP6f, su GECI de elección, en las neuronas del tití. El virus adenoasociado AAV a menudo se usa como un vector viral para introducir transgenes experimentalmente o para terapia génica. Sin embargo,en lugar de simplemente introducirlo en las neuronas tití usando un solo AAV, el equipo usó dos AAV, amplificando la expresión transgénica y relacionándola con la presencia / ausencia del compuesto doxiciclina, que podría agregarse o eliminarse del agua potable de los monos. Esto permitióel equipo expresó GCaMP6f en cantidades muy altas, lo que aumentó drásticamente el nivel de fluorescencia y permitió una visualización fácil que no sería posible sin su innovación.
"No solo era fácil ver la fluorescencia", señala Sadakane, "nuestro sistema reversible de expresión génica nos permitió obtener imágenes de las mismas neuronas durante varios meses".
Normalmente, la expresión extendida de transgenes de AAV puede dañar las neuronas, dificultando los estudios de imagen a largo plazo. Al eliminar la doxiciclina del agua potable de los monos, el equipo pudo detener la expresión de GCaMP6f durante más de un mes y prevenir el daño neuronal.luego capaz de volver a visualizar las mismas neuronas exactas después de reintroducir doxiciclina en el agua potable de los monos.
El nuevo método también permitió la visualización a nivel subcelular, con la detección de actividad en axones y dendritas individuales, y en capas corticales de hasta 400 micras desde la superficie del cerebro. Esto permitió que las neuronas de los individuos fueran fotografiadas en 3D, que es fundamental para investigar la organización de los circuitos corticales.
"El siguiente paso es mejorar la técnica para que pueda usarse con titíes despiertos y que se comporten", dice el líder del equipo, Tetsuo Yamamori. "Entonces podremos relacionar la actividad neuronal con el comportamiento y ver los cambios en las neuronas individuales que ocurrena través de la experiencia.
"Si bien muchas personas usan la microscopía de dos fotones con ratones, no pueden estudiar ciertos comportamientos complejos compartidos por los primates, incluido nosotros. Con nuestro nuevo método, podremos investigar cómo funcionan los cerebros de los primates a un nivel que antes no era posible".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por RIKEN . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
Referencia del diario :
Cita esta página :