CRISPR-Cas9 es la técnica de referencia para eliminar genes en líneas celulares humanas para descubrir lo que hacen los genes, pero la eficiencia con la que desactiva los genes puede variar enormemente.
Los investigadores de la Universidad de California, Berkeley, ahora han encontrado una manera de aumentar la eficiencia con la que CRISPR-Cas9 corta y desactiva genes hasta cinco veces, en la mayoría de los tipos de células humanas, lo que facilita la creación y el estudio de líneas celulares inactivadas y, potencialmente, deshabilitar un gen mutante como una forma de terapia humana.
Los científicos están descubriendo constantemente nuevos genes o las proteínas que codifican, pero es mucho más difícil descubrir su papel en el cuerpo o en la enfermedad. La clave para descubrir este papel es deshabilitar el gen para ver qué sucede cuando se elimina.
Si bien CRISPR-Cas9 puede acelerar el proceso de hacer líneas celulares inactivadas, los investigadores a veces deben hacer y detectar muchas variaciones de las tijeras genéticas para encontrar una que funcione bien. Los investigadores de UC Berkeley descubrieron que este proceso puede hacerse muchas veces más eficientecon un simple ajuste
La clave es introducir en la célula, junto con la proteína CRISPR-Cas9, fragmentos cortos de ADN que no coinciden con ninguna secuencia de ADN en el genoma humano. Los fragmentos cortos de ADN, llamados oligonucleótidos, parecen interferir con la reparación del ADNmecanismos en la celda para aumentar el rendimiento de edición de incluso CRISPR-Cas9s mediocres entre 2½ y 5 veces.
"Resulta que si haces algo realmente simple, solo alimenta las células con oligonucleótidos sintéticos económicos que no tienen homología en ninguna parte del genoma humano, las tasas de edición aumentan hasta cinco veces", dijo el investigador principal Jacob Corn, el director científico de la Iniciativa de Genómica Innovadora de UC Bekeley y profesor adjunto asistente de biología molecular y celular. La técnica aumenta la eficiencia de todos los CRISPR-Cas9, incluso aquellos que inicialmente no funcionaron en absoluto.
Con una mayor eficiencia, los investigadores tendrán un mayor éxito al crear los knockouts que desean y luego usar esas líneas celulares para explorar la función de un gen o un grupo de genes. Debido a que la mayoría de las líneas celulares de larga vida se derivan de las células cancerosas- incluyendo la línea celular HeLa muy popular - estas líneas celulares generalmente tienen más de las dos copias normales de cada gen. Esto puede dificultar la eliminación de todas las copias a la vez, y una mayor eficiencia aumenta en gran medida la posibilidad de éxito.
La alta eficiencia también es esencial cuando se eliminan genes para corregir mutaciones hereditarias en humanos. Los médicos han especulado sobre eliminar genes que hacen que las personas sean susceptibles a enfermedades infecciosas, como el SIDA, o propensas a trastornos autoinmunes, inflamatorios o neurodegenerativos. Sigue siendover si el enfoque descrito por Corn y sus colegas podría usarse en un contexto terapéutico, pero es muy efectivo para fines de investigación.
Los resultados se informarán el 17 de agosto en el diario en línea Comunicaciones de la naturaleza .
clave de reparación de ADN para el éxito de CRISPR-Cas9
La molécula CRISPR-Cas9 consiste en una proteína tijera, la proteína Cas9 y una dirección que le dice a Cas9 dónde unir el ADN y cortarlo. La técnica se basa en el hecho de que cuando se corta el ADN, los mecanismos de reparación de la célula no siemprereconstruya correctamente la cadena de ADN, pero cometa un error en la secuencia que inhabilita el gen y elimina su actividad.
La dirección, llamada ARN guía, es una cadena de 20 moléculas de ácido ribonucleico que son complementarias a la secuencia de ADN del gen objetivo. Este ARN guía se une al ADN como una tira de Velcro, configurando Cas9 para cortar el dobleADN trenzado.
Por qué algunos ARN guía funcionan bien, configurar Cas9 para cortar e inhabilitar un gen casi el 100 por ciento del tiempo, mientras que otros se unen pero rara vez o nunca eliminan el gen, ha sido un enigma desde que la técnica fue inventada por Jennifer Doudna deUC Berkeley y Emmanuelle Charpentier de la Universidad de Umea en 2012. La eficiencia de corte varía con el tipo de celda y la línea celular particular, dijo Corn.
Corn sospechaba que la eficiencia de corte ocasionalmente pobre de Cas9 podría estar relacionada con la forma en que se repara el ADN, ya que los mecanismos de reparación del ADN, las enzimas básicas de mantenimiento que reparan cualquier ruptura o eliminación en el ADN que podría conducir a una mutación mortal difieren de las célulasrazonó que las cadenas aleatorias de ADN, ninguna de ellas similar a cualquier ADN humano real es decir, no homólogo, podrían confundir el proceso de reparación y mejorar la tasa de éxito de la eliminación.
"Le da a la célula una pequeña patada para evitar que ocurra una reparación normal", dijo.
Representa la edición del gen CRISPR-Cas9 como una competencia entre el corte y la reparación del ADN: una vez que Cas9 corta, la célula reemplaza exactamente el ADN cortado, que Cas9 corta nuevamente, en un ciclo interminable de corte y reparación hasta que las enzimas de reparación cometen un errory el gen termina disfuncional. Quizás, dijo, los oligonucleótidos disminuyen la fidelidad del proceso de reparación, o hacen que la célula cambie a una reparación más propensa a errores que permita que Cas9 rompa más fácilmente el gen.
La próxima frontera, dijo, está tratando de aprovechar las peculiaridades de la reparación del ADN para mejorar la inserción de la secuencia, a fin de reemplazar un gen defectuoso con un gen normal y posiblemente curar una enfermedad genética.
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Materiales proporcionados por Universidad de California - Berkeley . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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