Un nuevo tinte fluorescente fotoestable para microscopía de súper resolución podría servir como una herramienta poderosa para visualizar eventos biológicos y detalles estructurales en células vivas en tiempo real durante períodos de registro prolongados.
La bioimagen por microscopía de fluorescencia es una técnica útil para estudiar la localización y el movimiento de las moléculas en las células vivas por fluorescencia. Sin embargo, la degradación gradual de los tintes fluorescentes cuando se expone a la luz de alta intensidad necesaria para la microscopía de súper resolución ha sido un obstáculo importante paraobservaciones a largo plazo.
En un nuevo estudio, publicado en línea en la revista Edición internacional Angewandte Chemie , un equipo de químicos y biólogos del Instituto de Bio-Moléculas Transformativas ITbM, la Universidad de Nagoya ha desarrollado un nuevo tinte fluorescente, "C-Naphox" con fotoestabilidad mejorada para permitir la obtención continua de imágenes de células vivas por microscopía STED, que se abrepuertas para observar eventos biológicos en tiempo real durante períodos prolongados con alta resolución.
Los avances en las técnicas de súper resolución, como la microscopía de reducción de emisión estimulada STED Premio Nobel de Química 2014 han permitido la visualización a escala nanométrica de los sistemas biológicos. La microscopía STED permite una resolución hasta diez veces mayor en las células vivas con respecto a los microscopios convencionales.empleando un haz de excitación de fluorescencia en combinación con un haz STED en forma de rosquilla circundante. Mientras que las moléculas en el centro están excitadas a un estado de mayor energía y fluorescentes, las moléculas expuestas al haz STED están confinadas al estado de energía del suelo.
Como la fluorescencia se detecta en el punto que no está expuesto al haz STED, esto permite detectar objetos que están separados por decenas de nanómetros nm = una billonésima parte de un metro. La resolución de la microscopía óptica convencional ha sidolimitado a la mitad de la longitud de onda de la luz, es decir, ~ 200 nm, de acuerdo con la ley establecida por Ernest Abbe en el siglo 19. Esto se debe a que la difracción de la luz difumina los objetos que están separados a menos de 200 nm en una sola imagen.los virus, el ADN y las proteínas que son de interés para los científicos de la vida suelen ser inferiores a 200 nm, la microscopía STED supera la limitación de la difracción de luz y permite la visualización de estructuras tan pequeñas en alta resolución.
No obstante, la intensidad de la luz requerida para la microscopía de fluorescencia de súper resolución es mucho mayor que la microscopía convencional, lo que conduce a la fotodegradación de las moléculas de colorante fluorescente. Como la resolución espacial de las imágenes STED se correlaciona con un aumento en la intensidad de la luz STED, la fotodegradación de los colorantes fluorescentesse convierte en un problema grave: también se sabe que los tintes fluorescentes fotorresistentes representativos como Alexa Fluor® 488 y ATTO 488 encuentran fotodegradación en la microscopía STED, lo que dificulta la realización de imágenes en vivo continuas de los sistemas biológicos mientras se conserva una alta resolución.
Para superar este problema de resolución reducida en imágenes STED debido a la fotodegradación, el equipo de ITbM dirigido por los investigadores principales Shigehiro Yamaguchi, químico sintético y Tetsuya Higashiyama, biólogo de plantas, han desarrollado un nuevo tinte fluorescente, C-Naphox, que ha mejorado la fotoestabilidad relativaa los tintes convencionales. C-Naphox ha demostrado ser extremadamente fotorresistente con casi ninguna degradación de fluorescencia incluso después de una imagen STED prolongada en células vivas.
C-Naphox óxido de naftofosfohole P con puente de diarilmetileno consiste en un marco aromático con un resto amino incorporado por sus propiedades donadoras de electrones y óxido de fósforo por sus propiedades de aceptación de electrones, lo que conduce a intensas emisiones de fluorescencia ".Las moléculas sintetizadas en el grupo Yamaguchi también han llevado a una alta intensidad de fluorescencia, es la estructura puenteada de carbono en C-Naphox la clave de su resistencia extremadamente alta a la luz de alta intensidad ", dice Aiko Fukazawa, profesora asociada en el grupo de Yamaguchi."He estado trabajando en la síntesis de marcos moleculares que contienen elementos específicos desde 2006, pero fue desde el comienzo de ITbM en 2013 que realmente comenzamos a centrarnos en sintetizar moléculas como sondas fluorescentes para la obtención de imágenes de células vivas", continúa.
Junto con Masayasu Taki, profesor asociado y Chenguang Wang, investigador postdoctoral en el grupo de Yamaguchi, optimizaron la estructura del tinte fluorescente para la obtención de imágenes de células vivas ". C-Naphox y otros derivados fueron rápidamente sintetizados por el Dr. Wang enmenos de diez pasos y se encontró que era estable al aire durante meses a temperatura ambiente ", dice Fukazawa." Además, C-Naphox no exhibió toxicidad significativa hacia las células a concentraciones micromolares que generalmente se requieren para la tinción celular ".
La fotoestabilidad del tinte recién sintetizado se demostró mediante experimentos de irradiación con una lámpara de xenón. La absorbancia relativa de C-Naphox se comparó con la de las sondas fluorescentes de imagen STED representativas disponibles comercialmente, Alexa Fluor® 488 y ATTO 488. Los resultados delos experimentos mostraron que más del 99% de C-Naphox permaneció intacto incluso después de 12 horas de irradiación, mientras que solo el 26% de Alexa Fluor® 488 permaneció presente después de 2 horas. Aunque el 97% de ATTO 488 persistió después de 2 horas de irradiación, la cantidadpresente se redujo al 59% después de 12 horas.
Las células HeLa se tiñeron con C-Naphox o Alexa Fluor® 488 y se expusieron a repetidas condiciones de imagen STED. Aunque las células teñidas con Alexa Fluor® 488 mostraron una disminución en la intensidad de la señal de fluorescencia después de 5 grabaciones, la intensidad de C-Naphoxpermaneció prácticamente sin cambios en las mismas condiciones.
"Estamos muy contentos de ver que C-Naphox mostró una fotoestabilidad excepcionalmente alta durante un período de tiempo relativamente largo", dicen Fukazawa y Taki. "El mejor momento de este trabajo fue cuando vimos que la fluorescencia de C-Naphox en HeLalas células persistieron y permanecieron sin cambios incluso después de grabar 50 imágenes en condiciones STED. "Las imágenes de células vivas fueron tomadas por Yoshikatsu Sato, el coordinador jefe del Centro de imágenes en vivo de ITbM". Como la microscopía STED es una herramienta extremadamente poderosa para visualizar estructuras extremadamente pequeñas, esperamos aplicar este tipo de moléculas fotorresistentes para estudiar eventos biológicos como la formación de filamentos de actina en las células ", dice Taki.
"C-Naphox es un tinte fluorescente extremadamente fotorresistente que permite obtener imágenes STED repetidas que han sido difíciles con los tintes convencionales. Actualmente estamos llevando a cabo más estudios de optimización para mejorar la practicidad de C-Naphox como una sonda fluorescente útil en tiempo continuolapso de imágenes STED de células vivas e imágenes multicolores ", dice Fukazawa.
"Nuestro trabajo consiste en diseñar moléculas que contengan elementos como boro, fósforo, silicio y azufre en el marco molecular habitual de carbono, nitrógeno y oxígeno. Estamos muy contentos de ver que nuestras moléculas se convierten en herramientas útiles para estudios biológicosy espero continuar trabajando con biólogos para descubrir nuevas moléculas y técnicas de alta resolución para comprender los fenómenos biológicos en los sistemas vivos ", dice Yamaguchi.
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Materiales proporcionado por Instituto de Bio-Moléculas Transformativas WPI-ITbM, Universidad de Nagoya . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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