La fluorescencia es una herramienta increíblemente útil para la biología experimental y es más fácil de aprovechar, gracias al trabajo de un grupo de investigadores de la Universidad de Chicago.
El grupo creó una nueva herramienta como parte de una clase de laboratorio dentro del programa de posgrado de Ciencias Biofísicas de la Universidad de Chicago, que permite a sus usuarios concentrarse en el espectro de estructuras específicas dentro de las muestras.
"La mayor parte del trabajo fue realizado por estudiantes graduados durante su primer semestre", dijo Adam Hammond, director del plan de estudios y profesor titular del programa de Ciencias Biofísicas en el Centro Gordon para Ciencias Integrativas. "Su entusiasmo y creatividad hicieron posible este proyecto"."
Como informa el grupo esta semana en el diario Revisión de instrumentos científicos , de AIP Publishing, el objetivo de su instrumentación es observar el espectro de luz que proviene de una parte de una muestra en un microscopio, pero no toda la muestra.
"El valor de un microscopio es que le permite observar las variaciones dentro de una muestra", explicó Hammond. "Queríamos poder preguntar, '¿cuál es el espectro de esa estructura específica en este momento?' Esto no esexiste un nuevo deseo e instrumentos que pueden hacerlo, pero ninguno, que yo sepa, tan simple como el nuestro "
Durante su primer año en la escuela de posgrado, Peter Dahlberg, primer autor del artículo que ahora está en la Universidad de Stanford en California, construyó un microscopio de excitación selectiva. "Inconscientemente, creo que la idea comenzó entonces", dijo. "¿Por qué no hacer lo mismo, pero a la inversa? "
¿Cómo funciona la herramienta del grupo? Primero, divide la luz que proviene de una muestra. La mitad va a una cámara para obtener imágenes normales y la otra mitad va a un espectrómetro. Pero antes de que llegue al espectrómetro, esa mitad pasaalgunos componentes ópticos que permiten a los usuarios elegir cualquier parte arbitraria de la imagen y bloquear todo lo demás.
"No hay nada complicado en estos componentes ópticos: un modulador de luz espacial SLM entre polarizadores cruzados", dijo Hammond. "Los SLM son comunes ahora, con al menos tres en muchos proyectores digitales modernos. Tienen una matriz de píxeles quecada uno puede manipular la fase de la luz que los atraviesa "
Aunque hay varios trucos que puedes hacer con un SLM, el grupo está usando el más sencillo.
continuó: "Enfocamos la imagen de la muestra en el SLM y cambiamos la fase de solo aquellos píxeles de los que queremos obtener un espectro", continuó. "La luz desplazada pasa a través de un segundo polarizador; todo lo demás se bloquea.Luego, la luz se recoge y se puede enviar a cualquier tipo de instrumento óptico que elija. En este momento lo enviamos a un pequeño espectrómetro UV / Vis para obtener un espectro completo ".
El instrumento del grupo es, tal vez, mejor resumido como una "herramienta de caballo de batalla". Sus conceptos y componentes simples pueden adaptarse fácilmente para muchos propósitos diferentes y agregarse a los microscopios existentes de manera fácil y económica.
"Nos propusimos construirlo para un uso específico: para medir el cambio espectral de los indicadores fluorescentes", dijo Hammond. "Realmente no pensamos en hacerlo versátil o en cómo organizar el SLM y los polarizadores cuando comenzamos.Pero tuvimos una serie agradable de realizaciones en el camino "
Una de esas realizaciones fue que su instrumento también podría usarse para mediciones de absorbancia.
"A menudo, las muestras más importantes son pequeñas y difíciles de crear o purificar, como formas de cristal", dijo. "Es un trabajo arduo purificar los dos tipos uno del otro en cantidades suficientes para llenar una cubeta. Cuandocoloque la mezcla en un portaobjetos de microscopio, se hace más fácil. Los cristales se pueden medir de uno en uno, al igual que las células que expresan cromóforos variables moléculas responsables del color. Esto abre un área completamente nueva que no era parte de nuestroPlan original."
El instrumento del grupo puede "tomar el espectro completo de una o más regiones de interés definidas por el usuario mientras captura simultáneamente imágenes de fluorescencia estándar de todo el campo de visión", dijo Hammond. "Entonces, lo que puede hacer con él depende de la muestra. Lo estamos usando ahora para seguir sondas fluorescentes para pH y calcio. Pero un ejemplo de una aplicación muy diferente es su capacidad para identificar microorganismos individuales dentro de una muestra mixta por su huella digital de absorbancia ".
¿Qué sigue para los investigadores?
"Al usar una fuente de excitación pulsada, la vida útil de fluorescencia de una sonda podría medirse a partir de una región de interés seleccionada", dijo Hammond. "Una aplicación potencial interesante está dentro del campo de la neurociencia para resolver potenciales de acción única con colorantes que sonsensible al potencial de membrana. Las mediciones de vida útil de fluorescencia proporcionan una ventaja sobre las mediciones de fluorescencia directa porque son independientes de la concentración de la sonda ".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Americano de Física AIP . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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