Los bioingenieros de la Universidad de Rice han encontrado nuevas técnicas para la edición precisa del genoma que son más precisas y tienen menos errores fuera del objetivo.
Las nuevas estrategias se comparten en tres artículos en un próximo número especial de la revista Nature Terapia molecular sobre la mejora de la revolucionaria técnica de edición del genoma llamada CRISPR-Cas9.
El profesor de bioingeniería Gang Bao y sus colegas presentan ideas para maximizar la edición de genes en el objetivo con catalizadores biológicos capaces de cortar el ADN llamados "nucleasas manipuladas". Varios de estos sistemas se han estudiado durante años, pero durante los últimos tres, la promesa de cortarla edición y pegar a través de CRISPR-Cas9 ha captado la atención de científicos de todo el mundo.
CRISPR-Cas9, un sistema de defensa natural en bacterias, permite a los investigadores diseñar una secuencia corta de ARN llamada "ARN guía" que se dirige a una sección específica del código genético ADN en una célula. Una proteína Cas9 asociada luego corta lasección, lo interrumpe o lo reemplaza con el código deseado.
Así es como las bacterias usan CRISPR-Cas9 para inmunizarse a sí mismas de enfermedades. La exposición a un invasor hace que las bacterias se adapten agregando la firma genética del invasor a una base de datos CRISPR. Las bacterias luego reconocen a los enemigos futuros y los destruyen con una proteína Cas9 apropiada.
Hace aproximadamente tres años, los investigadores descubrieron que la bacteria CRISPR-Cas9 podría modificarse para editar el ADN en células humanas, por ejemplo, reemplazando secuencias mutantes con secuencias normales o "de tipo salvaje", de la misma manera que una bacteria almacena unfirma del ADN del invasor. Se considera que la técnica tiene un gran potencial para el modelado y tratamiento de enfermedades, la biología sintética y la disección de vías moleculares.
Pero CRISPR-Cas9 sigue siendo vulnerable a recortar las secuencias incorrectas, llamadas "fuera del objetivo", además de las correctas. En aplicaciones terapéuticas, dijo Bao, el corte fuera del objetivo por CRISPR-Cas9 podría causar muchos dañosefectos, incluido el cáncer.
Bao, quien se trasladó a Rice's BioScience Research Collaborative BRC en 2015 con una subvención del Cancer Prevention and Research Institute of Texas, está estudiando formas de refinar CRISPR-Cas9, que describió como "nano tijeras para editar genes".
Uno de sus objetivos es tratar la enfermedad hereditaria anemia de células falciformes, que espera que CRISPR-Cas9 eventualmente cure. Pero primero la terapia debe mejorar mucho para evitar objetivos fuera de los objetivos que pueden causar efectos secundarios no deseados.
En dos de los artículos, los investigadores estudian diferentes ortólogos: proteínas Cas9 de especies con los mismos ancestros que el Streptococcus pyogenes espía bacteria comúnmente utilizada en CRISPR / Cas9.
"Nuestro enfoque en estos artículos es explorar la posibilidad de usar diferentes ortólogos Cas9", dijo Bao. "Hay muchas posibilidades".
En el primer artículo, Bao y su grupo utilizaron experimentos con células de mamíferos para caracterizar un sistema CRISPR-Cas9 de la bacteria Neisseria meningitides Nme. Se diferencia de espía de una manera que los bioingenieros puedan usar para reducir el riesgo de ediciones fuera del objetivo, dijo.
Esa diferencia radica principalmente en una secuencia de código que no es parte del objetivo, pero que está cerca. Conocido como motivo adyacente al protoespaciador PAM, es un marcador para las secuencias de ADN objetivo y es necesario para la unión a la proteína Cas9. En espía Edición de Cas9, la secuencia de PAM generalmente tiene tres nucleótidos de longitud. Para Nme, la secuencia de PAM requerida es significativamente más larga: ocho nucleótidos. Si bien Nme puede encontrar menos objetivos, es más probable que esos objetivos sean los correctos, según elinvestigadores. Eso, argumentan, puede convertirlo en una alternativa más segura para la edición de genes.
El segundo artículo, una colaboración con colegas de la Universidad de Friburgo, Alemania, aborda la edición de genes humanos altamente específicos utilizando el sistema inmunológico de otra bacteria. Para este estudio, las proteínas Cas9 de Spy fueron reemplazadas por Streptococcus termófilos proteínas Sth que también reconocen PAM más largas. Las pruebas realizadas en células humanas encontraron que las proteínas Sth con requisitos de PAM más estrictos eran significativamente mejores que espía Proteínas Cas9 para evitar objetivos externos.
Bao y compañía también analizaron el efecto de las protuberancias en el ADN y el ARN que pueden influir en la orientación. Las protuberancias aparecen cuando una secuencia es un nucleótido más larga o un nucleótido más corta que la secuencia de ADN esperada dirigida por el ARN guía.
"Descubrimos que incluso con protuberancias de ADN o ARN, la proteína Cas9 aún puede cortar", dijo. "Esa es una contribución única. Nadie vio que ese sería el caso, pero lo demostramos. En consecuencia, hemos desarrollado unHerramienta basada en la web para buscar tres casos de posibles sitios fuera del objetivo que contienen desajustes de bases, protuberancias de ARN y protuberancias de ADN ".
Bao señaló que las proteínas Nme y Sth Cas9, a diferencia de Spy, son lo suficientemente pequeñas como para ser empaquetadas dentro de un virus adenoasociado para la administración y el tratamiento de células específicas en un animal. "Esa es otra ventaja, y por eso queremos continuarpara explorar estos dos sistemas ", dijo.
El tercer artículo es una revisión de las técnicas actuales de CRISPR-Cas9 que se centra en las herramientas de edición del genoma disponibles para la selección de objetivos, los métodos experimentales y la validación. Bao y su equipo también presentan una lista de desafíos aún por resolver para eliminar lasefectos de destino.
Dijo que hay un camino a seguir, representado en parte por su investigación de dos nuevos sistemas bacterianos, así como por el hecho de que CRISPR-Cas9 es una técnica mucho más fácil de implementar en el laboratorio que otros sistemas de edición del genoma como TALEN ynucleasa de dedos de zinc.
Bao dijo que, a diferencia de las antiguas técnicas de edición del genoma, CRISPR-Cas9 es lo suficientemente sencillo para que los estudiantes lo aprendan y lo utilicen en poco tiempo.
Bao espera establecer su laboratorio como un punto focal para la edición del genoma en el Texas Medical Center. Con ese fin, reunió a la comunidad de edición del genoma de TMC para un taller muy concurrido en el BRC en diciembre pasado.
"Tuvimos muchas buenas discusiones", dijo. "Una cosa que me gustaría estimular es la formación de un consorcio entre los muchos laboratorios de TMC que utilizan CRISPR. Tienen la necesidad de diseñar sistemas CRISPR para diferentes aplicaciones, perohay muchos problemas comunes. Si trabajamos juntos, será más fácil abordarlos ".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de Rice . Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
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