Un equipo de investigadores del Hospital General de Massachusetts MGH ha encontrado una manera de ampliar el uso y la precisión de las poderosas herramientas de edición de genes llamadas nucleasas guiadas por ARN CRISPR-Cas9. En su informe que recibió la liberación anticipada en línea en Naturaleza , los investigadores describen versiones evolucionadas de la enzima Cas9 de corte de ADN que son capaces de reconocer un rango diferente de secuencias de ácido nucleico que es posible con la forma natural de Cas9 que se ha utilizado hasta la fecha.
"En nuestro artículo mostramos que los sitios en genes humanos y de pez cebra que antes no podían ser modificados por Cas9 de tipo salvaje ahora pueden ser seleccionados con las nuevas variantes que hemos diseñado", dice Benjamin Kleinstiver, PhD, investigador en elUnidad de Patología Molecular MGH y autor principal de la Naturaleza artículo. "Esto permitirá a los investigadores apuntar a una gama ampliada de sitios en una variedad de genomas, lo que será útil para aplicaciones que requieren una orientación muy precisa de secuencias de ADN".
Las nucleasas CRISPR-Cas9 consisten en la enzima bacteriana Cas9 y una molécula corta de ARN de 20 nucleótidos que coincide con la secuencia de ADN objetivo. Además de la coincidencia de ARN / ADN, la enzima Cas9 necesita reconocer una secuencia de nucleótidos específica llamada protospacermotivo adyacente PAM adyacente al ADN objetivo. La forma más utilizada de Cas9, derivada de la bacteria Streptococcus pyogenes y conocida como SpCas9, reconoce secuencias PAM en las cuales cualquier nucleótido es seguido por dos bases de ADN de guanina. Esto limita las secuencias de ADN.que puede orientarse usando SpCas9 solo a aquellos que incluyen dos guaninas secuenciales.
Para sortear esta limitación, el equipo de MGH estableció un sistema de ingeniería que les permitió evolucionar rápidamente la capacidad de SpCas9 para reconocer diferentes secuencias PAM. De una colección de variantes de SpCas9 mutadas al azar, identificaron combinaciones de mutaciones que permitieron a SpCas9 reconocernuevas secuencias PAM. Estas variantes evolucionadas esencialmente duplican el rango de sitios que ahora pueden ser seleccionados para la edición de genes usando SpCas9. Afortunadamente, también identificaron una variante de SpCas9 que era menos probable que indujera las mutaciones genéticas fuera del objetivo a veces producidas por CRISPR-Cas9nucleasas, un problema originalmente descrito en un estudio de 2013 dirigido por J. Keith Joung, MD, PhD, jefe asociado de Investigación en el Departamento de Patología de MGH y autor principal del estudio actual. "Esta variante evolucionada adicional con mayor especificidad debe ser inmediataútil para todos los investigadores que actualmente usan SpCas9 de tipo salvaje y deberían reducir las frecuencias de mutaciones no deseadas fuera del objetivo ", dice Joung.
"Quizás lo más importante", agrega, "nuestros hallazgos proporcionan la primera demostración de que las actividades de SpCas9 pueden verse alteradas por la evolución dirigida de la proteína. De hecho, mostramos en nuestro artículo que las formas de Cas9 se encuentran en otras dos bacterias:Staphylococcus aureus y Streptococcus thermophilus también pueden funcionar en nuestro sistema de evolución bacteriana, lo que sugiere que también deberíamos poder modificar sus funciones. Este trabajo solo rasca la superficie del rango de PAM que puede ser el objetivo de Cas9, y creemos queotras propiedades útiles de la enzima pueden modificarse mediante un enfoque similar, permitiendo la personalización potencial de muchas características importantes ". Joung es profesor de Patología en la Facultad de Medicina de Harvard.
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Materiales proporcionados por Hospital General de Massachusetts . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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