Dos nuevos estudios de la Universidad de California, Berkeley, deberían dar a los científicos que usan CRISPR-Cas9 para la ingeniería del genoma una mayor confianza de que no editarán el ADN incorrecto sin darse cuenta.
La técnica de edición de genes, creada por la bioquímica de UC Berkeley Jennifer Doudna y su colega europea Emmanuelle Charpentier, ha tomado por asalto la investigación y las comunidades clínicas como una forma fácil y económica de realizar cambios precisos en el ADN para desactivar genes, corregir genéticatrastornos o insertar genes mutados en animales para crear modelos de enfermedades humanas.
Los dos nuevos informes del laboratorio de Doudna y el del colega de UC Berkeley Robert Tjian muestran con mucho más detalle cómo la proteína Cas9 busca a través de miles de millones de pares de bases en una célula para encontrar la secuencia de ADN correcta, y cómo Cas9 determina si se debe unir,o unirse y cortar, iniciando así la edición de genes. Basado en estos experimentos, Cas9 parece tener al menos tres formas de verificación para asegurarse de que encuentra el ADN objetivo correcto antes de dar el paso irrevocable de hacer un corte.
"CRISPR-Cas9 ha evolucionado para una orientación precisa del ADN, y ahora entendemos la base molecular de su actividad de búsqueda y corte, que ayuda a limitar la edición de ADN fuera del objetivo", dijo Doudna, investigador del Instituto Médico Howard Hughes en la UCBerkeley y profesor de biología molecular y celular y de química. Tjian es presidente del Instituto Médico Howard Hughes y profesor de biología molecular y celular de UC Berkeley.
Los estudios también ilustran qué tan bien CRISPR / Cas9 funciona en células humanas y animales, eucariotas, a pesar de que "la técnica fue inventada por bacterias para protegerse de la gripe", dijo Doudna.
CRISPR-Cas9 es un híbrido de proteínas y ARN, el primo del ADN, que funciona como un sistema eficiente de búsqueda y recorte en bacterias. Surgió como una forma de reconocer y matar virus, pero Doudna y Charpentier se dieron cuentaque también podría funcionar bien en otras células, incluidos los humanos, para facilitar la edición del genoma. La proteína Cas9, obtenida de la bacteria Streptococcus pyogenes, funciona junto con un ARN "guía" que se dirige a un tramo complementario de ADN de 20 nucleótidos.El ARN identifica una secuencia que coincide con estos nucleótidos, Cas9 corta la hélice de ADN bicatenario.
Un estudio, publicado en la edición del 13 de noviembre de ciencia rastreó las moléculas de ARN Cas9 a través del núcleo de las células de mamíferos mientras buscaban rápidamente a través del genoma completo para encontrar y unirse solo a la región objetivo y no a otra.
"Es una locura que el complejo Cas9 logre escanear el vasto espacio de los genomas eucariotas", dijo el estudiante graduado Spencer Knight, primer autor de la ciencia papel
Estudios anteriores habían sugerido que hay muchas regiones de ADN de aspecto similar que Cas9 podría unir y cortar, lo que podría limitar su utilidad si la precisión fuera importante. Estas regiones fuera del objetivo podrían compartir tan solo cuatro o cinco nucleótidos con los 20-cebador de nucleótidos, lo suficiente para que Cas9 lo reconozca.
"Hay una gran cantidad de enlaces fuera del objetivo por parte de Cas9, pero descubrimos que estas interacciones son muy breves, de milisegundos a segundos, antes de que Cas9 avance", dijo.
Debido a que estas uniones exploratorias, tal vez hasta 300,000 de ellas, a menudo son de corta duración, unos pocos miles de complejos CRISPR-Cas9 pueden rastrear todo el genoma para encontrar un tramo específico de ADN. Cas9 también debe reconocer un cortosecuencia de ADN de tres pares de bases que sigue inmediatamente a la secuencia del cebador, denominada PAM, que ocurre aproximadamente 300 millones de veces dentro del genoma humano.
"Si Cas9 se limitara durante decenas de segundos o minutos en cada sitio fuera del objetivo, nunca, nunca podría encontrar un objetivo y cortarlo de manera oportuna", dijo Knight.
punto de control final de Cas9
El otro estudio, publicado en línea el 28 de octubre en Naturaleza mostró que una vez que Cas9 se une a una región de ADN, realiza otra comprobación antes de que dos secciones distantes del complejo de proteínas Cas9 se unan, como las hojas de una tijera, para alinear con precisión los sitios activos que cortan el ADN bicatenario.
"Descubrimos que Cas9 guiado por ARN puede unir algunas secuencias de ADN fuera del objetivo, que difieren del objetivo correcto por unas pocas mutaciones, muy estrechamente. Sorprendentemente, sin embargo, la región de Cas9 que hace el corte está inhibida debido ala coincidencia imperfecta. Pero cuando se encuentra el ADN que coincide correctamente, Cas9 sufre un gran cambio estructural que libera esta inhibición y desencadena el corte del ADN ", dijo el primer autor Samuel Sternberg, quien recientemente recibió su doctorado en la Universidad de Berkeley.para observar estos cambios utilizando una versión marcada con fluorescencia del complejo Cas9.
"Creemos que este cambio estructural es el último punto de control, o etapa de corrección de pruebas, de la reacción de selección de ADN", dijo. "Primero, Cas9 reconoce un segmento corto de ADN junto al objetivo, el PAM, y luego el objetivoEl ADN se combina con el ARN guía a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick. Finalmente, cuando se identifica una combinación perfecta, la última parte de la proteína se coloca en su lugar para permitir el corte e iniciar la edición del genoma ".
Una proteína Cas9 más pequeña de una especie diferente de bacteria, Staphylococcus aureus, probablemente explota la misma estrategia para mejorar la precisión de la orientación del ADN, lo que sugiere que "esta característica importante se ha conservado a lo largo del tiempo evolutivo", agregó.
"Esta es una buena noticia, ya que sugiere que tiene más de un punto de control para garantizar la unión correcta de Cas9", dijo Knight. "No solo hay una regulación de secuencia, también hay una regulación temporal: tiene que comprometerse con el ADN yestacione el tiempo suficiente para que se pueda reorganizar y cortar ".
Los descubrimientos de Doudna, Tjian y sus equipos arrojan luz sobre la base molecular de los efectos fuera del objetivo durante las aplicaciones de edición del genoma, y pueden guiar el diseño futuro de variantes Cas9 más precisas.
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de California - Berkeley . Original escrito por Robert Sanders. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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