Los científicos de Johns Hopkins han desarrollado un método simplificado y "reglas" de eficiencia que lo acompañan para introducir nuevas secuencias de ADN en las células después de usar la herramienta de corte de genes conocida como CRISPR. Los científicos dicen que el método, basado en pruebas con embriones de ratón y milesde células humanas, podría mejorar la consistencia y la eficiencia de la edición del genoma.
El nuevo método y su desarrollo se describen en línea en el 28 de noviembre en el Actas de la Academia Nacional de Ciencias .
"CRISPR es una herramienta para ayudar a los científicos a modificar el genoma, predecir el resultado de ciertos rasgos y estudiarlos, pero la herramienta en sí solo crea roturas en el genoma. No controla cómo se inserta una nueva secuencia de ADN en el genoma,"dice Geraldine Seydoux, Ph.D., profesora de Huntington Sheldon en Medical Discovery en el Departamento de Biología Molecular y Genética y vicedecana de investigación básica en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, e investigadora del Instituto Médico Howard Hughes.
"Nos propusimos estudiar cómo las células reparan las roturas inducidas por CRISPR con el objetivo de utilizar el proceso de reparación de ADN natural de la célula para introducir nuevas secuencias en el genoma. Nos sorprendió descubrir que las células copiarán fácilmente secuencias de ADN extraño para repararEl ADN se rompe, siempre que los ADN extraños sean lineales ", agrega Seydoux." Al estudiar cómo se copian los fragmentos extraños de ADN durante el proceso de reparación, se nos ocurrieron algunas reglas simples para hacer que la edición del genoma sea lo más eficiente posible, optimizar la herramienta,y hazlo con confianza "
CRISPR, que significa repetición palindrómica corta agrupada regularmente entre espacios, ha ganado popularidad entre los científicos en los últimos cinco años como una herramienta para cortar eficientemente el ADN. Fue adaptado para su uso en células de mamíferos a partir de un proceso de defensa viral natural en células bacterianas queimplica crear cortes letales en el ADN viral. Esencialmente, la herramienta es un conjunto aerodinámico de "tijeras" moleculares.
La creencia predominante, entre los científicos, es que las células reparan las roturas del ADN insertando un conjunto aleatorio de nucleótidos, los componentes químicos del ADN. Esto generalmente destruye cualquier gen que se encuentre en el lugar donde se rompe el ADN.
También es bien sabido por los científicos que, ocasionalmente, las células usan una fuente diferente, una secuencia de otra pieza de ADN o ADN "donante" para sellar la ruptura en el ADN. Sin embargo, la nueva secuencia "donante" no puedeinsertarse por sí mismo en un espacio vacío en el genoma.
En cambio, el nuevo ADN del donante necesita una especie de cinta adhesiva en cada extremo para ayudarlo a pegarse dentro del hueco hecho por el corte. Los científicos se refieren a esta cinta como los brazos "homológicos" del ADN del donante.
Los brazos de homología consisten en nucleótidos que se superponen a las partes intactas del ADN con el código genético correspondiente. Esto ayuda al ADN del donante a "adherirse" al ADN intacto.
Sin embargo, los científicos consideraron el uso del ADN del donante como una forma ineficiente de reparar el genoma, suponiendo que requería brazos de homología largos, especialmente cuando se insertaba una secuencia de ADN larga, y ADN monocatenario o circular, que son difíciles de preparar en tamaños largos.
A medida que los científicos adquirieron más experiencia con CRISPR, Seydoux dice: "Surgieron preguntas sobre las reglas de diseño óptimas para el ADN del donante y la longitud de los brazos de homología".
Buscando respuestas a estas preguntas, los científicos de Johns Hopkins insertaron varias combinaciones de ADN donante en las células de riñón embrionario humano, conocidas por su capacidad de crecer bien y por su uso frecuente en la investigación del cáncer. Los científicos utilizaron ADN donante con un gen que codificapara una proteína fluorescente, que brilla en verde en la membrana nuclear de la célula cuando la inserción del gen es exitosa.
Alexandre Paix, investigador asociado de Johns Hopkins, descubrió que los fragmentos de ADN lineales funcionan muy bien como donantes y son de dos a cinco veces más eficientes que los ADN circulares conocidos como plásmidos en las células humanas ". El ADN lineal es muy fácil de preparar en el laboratorio, usando PCR ", dice Paix, refiriéndose a las herramientas de reacción en cadena de la polimerasa, que se utilizan para amplificar el ADN.
Paix también probó varias longitudes de brazos de homología. Encontró que el punto óptimo para los brazos de homología es de unos 35 nucleótidos de longitud, mucho más corto de lo que los científicos usan típicamente.
Específicamente, se encontró que los brazos de homología de 33 a 38 nucleótidos de longitud tuvieron tanto éxito como aquellos con 518 nucleótidos, produciendo entre 10 y 20 por ciento de ediciones exitosas en condiciones óptimas. En contraste, cuando los científicos probaron los brazos de homología de 15 yCon 16 nucleótidos de longitud, las tasas de éxito de inserción se redujeron a la mitad. Repitieron estos resultados en tres ubicaciones diferentes en el genoma humano.
También encontraron que la secuencia recién insertada, sin contar los brazos de homología, puede tener hasta 1,000 nucleótidos de longitud.
El equipo logró tasas de éxito entre 10 y 50 por ciento con insertos que varían de 57 a 993 nucleótidos de longitud. Las secuencias más cortas se insertaron con más éxito que las más largas. Por ejemplo, se insertaron con éxito nuevas secuencias que tenían 57, 714 y 993 nucleótidos de largo45.4, 23.5 y 17.9 por ciento del tiempo, respectivamente. Más allá de 1,000 nucleótidos, los nuevos insertos con 1,122 y 2,229 nucleótidos tuvieron poco éxito, aproximadamente 0.5 por ciento del tiempo ". A ese tamaño, se hace muy difícil introducir la cantidad de donanteSe necesita ADN para editar. Las células tienden a "ahogarse" en tanto ADN ", dice Seydoux.
Finalmente, el equipo también descubrió que la tasa de éxito de la edición alcanza su punto máximo cuando la nueva secuencia se coloca dentro de 30 nucleótidos del sitio de corte CRISPR. "Más allá de 30 nucleótidos, la inserción no es viable", dice Seydoux.
"Estos parámetros deberían acomodar la mayoría de los genes que los científicos buscan editar. De hecho, la mayoría de los experimentos implican editar solo dos o tres nucleótidos cerca del sitio de corte CRISPR", agrega Seydoux.
El equipo de investigación también probó si el mismo enfoque podría funcionar en embriones de ratón. Usando un fragmento de PCR con brazos de homología de 36 nucleótidos, el equipo insertó con éxito una secuencia de 739 nucleótidos que codifica una proteína fluorescente en 27 de 87 31 por ciento embriones de ratón
El equipo de investigación de Seydoux ya está utilizando las reglas de reparación para estudiar el ADN en Caenorhabditis elegans, una especie de gusano, y los investigadores están estudiando si las reglas de reparación se aplican a otros tipos de células humanas.
Antes de que las pautas se adopten ampliamente, Seydoux dice que deberían probarse en más tipos de células humanas y otros organismos.
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Materiales proporcionado por Medicina Johns Hopkins . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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