La microscopía de luz es la única forma en que podemos mirar dentro de una célula viva, o tejidos vivos, en tres dimensiones. Un microscopio electrónico solo ofrece una vista bidimensional, y la muestra orgánica se quemaría rápidamente debido al calor extremodel haz de electrones, y por lo tanto no se puede observar vivo. Además, al marcar las biomoléculas de la estructura que nos interesa con una molécula fluorescente especialmente diseñada, podemos distinguirla del entorno: esto es microscopía de fluorescencia.
Hasta mediados de la década de 1990, la microscopía de fluorescencia se vio obstaculizada por la física básica: debido al límite de difracción, las características de la muestra más cercanas a aproximadamente 250 nanómetros se verían borrosas juntas. Los virus y las proteínas individuales son mucho más pequeños que esto, por lo que podríanno se estudiará de esta manera, pero alrededor de 1994, en una maravillosa lección que nos enseña que debemos tener cuidado al aplicar principios físicos fundamentales, Stefan Hell descubrió la microscopía de reducción de emisiones estimuladas STED, que ahora es uno de los varios enfoques de microscopía óptica que logran"superresolución", resolución más allá del límite de difracción. Recibió el Premio Nobel de Química en 2014 "por el desarrollo de microscopía de fluorescencia superresuelta", junto con Eric Betzig y William Moerner.
Para ver por qué el límite de difracción es un problema, imagine que la estructura de interés es muy pequeña, digamos, de 50 nanómetros de ancho, como un virus, y ha sido marcada con una biomolécula fluorescente. Ahora imagine iluminarlo con un punto láser, digamos, 200 nanómetros de diámetro. Las moléculas marcadoras iluminadas emiten luz espontáneamente, en momentos aleatorios, por fluorescencia, con una probabilidad que cae rápidamente con el tiempo. Los fotones de muchas moléculas fluorescentes se enfocan en un detector usando lentes, creando un único píxel sin características.no completamente brillante porque solo una pequeña proporción de la muestra en el círculo iluminado contiene moléculas fluorescentes. Si fuera a mover el láser 200 nanómetros en cualquier dirección, a donde, en este ejemplo, no hay moléculas fluorescentes, la señal ciertamente iráoscuro. Entonces, este píxel bastante oscuro nos dice que hay algo presente dentro de esta área de muestra de 200 nanómetros de diámetro. El límite de difracción nos impide formar píxeles de menor tamañoáreas, si utilizamos el enfoque básico.
La idea física de la microscopía STED es muy simple. Con el punto láser iluminando nuevamente la región alrededor de la pequeña estructura fluorescente, suponga que de alguna manera detiene la luz que se envía al detector desde un área tan grande como sea posible dentro del punto, dejando unpunto mucho más pequeño, digamos, 60 nanómetros de diámetro. Ahora, si mueve el láser 60 nanómetros en cualquier dirección y la señal se oscurece, el píxel en la imagen representa la presencia de una estructura de hasta 60 nanómetros de ancho. El límite de difracción ha sido superadoPor supuesto, uno de esos píxeles no tiene características, pero se puede construir una imagen nítida de las mitocondrias escaneando y grabando muchos píxeles de brillo variable.
El descubrimiento ganador del Premio Nobel de Stefan Hell consiste en dos ideas. Primero, pensó en la idea de detener el envío de luz al detector desde un área lo más grande posible dentro de un punto iluminado cuyo tamaño coincida con el límite de difracción. Segundo, éldescubrió cómo lograrlo.
Dos láseres iluminan el mismo punto. El primer láser excita los electrones de la molécula marcadora y se descomponen espontáneamente a su estado fundamental, cada uno emitiendo un fotón visible de una longitud de onda específica. Esto es fluorescencia. El proceso es aleatorio, con elLa probabilidad de emisión disminuye con el tiempo con bastante rapidez, lo que significa que la mayoría de los fotones se emiten dentro de los primeros nanosegundos de la muestra que se está iluminando. Un segundo láser, el "haz STED", formado con un agujero en el medio para no afectar a las moléculas marcadoras.allí, está sintonizado para estimular la emisión de un fotón por la molécula marcadora excitada en el anillo externo. Pero, ¿cómo se distinguen estos fotones de los fotones emitidos desde el medio?
El proceso de emisión desde el anillo exterior también es aleatorio pero ocurre mucho más rápido, la probabilidad disminuye rápidamente, lo que significa que la mayoría de estos fotones se emiten dentro de un nanosegundo más o menos. A medida que los dos haces superpuestos escanean a través de la muestra, por el momentoel centro del anillo está fluorescente, las moléculas circundantes ya han sido forzadas a su estado fundamental mediante la emisión de un fotón; se han "apagado". La técnica de microscopía STED se basa en un tiempo inteligente de esta manera. En principio, el tamañodel punto central brillante se puede hacer tan pequeño como desee, por lo que es posible cualquier resolución. Sin embargo, el "haz STED" en forma de rosquilla estaría entregando energía en forma de luz láser visible concentrada a un área más grande de la vidacelda, arriesgándose a matarlo.
Sin embargo, el proceso no es ideal, y la imagen resultante pierde algo de nitidez porque algunas moléculas marcadoras en el anillo exterior no están desactivadas correctamente, el proceso es probabilístico, después de todo, y cuando hacen fluorescencia contaminan la señalSin embargo, debido a la diferente sincronización de la emisión espontánea y estimulada, los primeros fotones en llegar al detector provienen de regiones iluminadas por la mayor intensidad del haz STED, y los últimos fotones en llegar son probablemente de las moléculas marcadoras ubicadasen el punto central. Por lo tanto, al esperar un corto tiempo alrededor de un nanosegundo antes de grabar la imagen, la mayoría de los fotones del anillo exterior se pueden filtrar. Esto se llama "Microscopía STED de tiempo limitado".se logra a través de un proceso llamado deconvolución.
La invención de la microscopía de súper resolución marcó un salto adelante en las ciencias de la vida. Los organismos vivos se pudieron observar a una resolución sin precedentes. Sin embargo, las secuencias de imágenes de lapso de tiempo no se pudieron hacer en un período de tiempo decente porque las moléculas marcadorasse degradaría bajo el intenso haz de STED y detendría la fluorescencia. Este es el problema del foto-blanqueo. Las moléculas marcadoras dañadas también pueden volverse tóxicas para la célula.
El problema de foto-blanqueo resuelto
Shigehiro Yamaguchi y Masayasu Taki, del Instituto de Biomoléculas Transformativas de la Universidad de Nagoya ITbM, lideraron un equipo de investigación que ha desarrollado una molécula marcadora, llamada "MitoPB Yellow", que es absorbida por la membrana interna de las mitocondrias, incluida lacristae, las estructuras en forma de pliegue, y tiene una larga vida útil bajo un haz STED. La idea de la molécula marcadora dirigida a las mitocondrias surgió del coautor Chenguang Wang, del ITbM. También es posible obtener imágenes STED multicolores con un solo láser STEDposible; y los investigadores esperan que los marcadores fluorescentes similares a MitoPB Yellow también encuentren una amplia gama de aplicaciones en otras técnicas de superresolución como las desarrolladas por Eric Betzig y William Moerner.
Para demostrar la utilidad práctica de MitoPB Yellow para la obtención de imágenes de células vivas, el grupo colocó las mitocondrias en condiciones que se sabe que causan ciertos cambios estructurales, pero hasta ahora solo se han observado mediante microscopía electrónica de transmisión, que no se puede utilizar encélulas vivas. Las mitocondrias fueron tratadas con un reactivo que suprime la replicación del ADN, induciendo disfunción, para observar sus procesos de supervivencia y muerte.
Luego, usando la microscopía STED de tiempo limitado, el equipo de investigación hizo imágenes fijas a una resolución de 60 nanómetros aproximadamente una milésima parte del ancho de un cabello humano, así como secuencias de imágenes de lapso de tiempo que muestran las mitocondrias respondiendo a una privación denutrientes cambiando de forma para sobrevivir. Las secuencias de imágenes largas, de hasta 600 imágenes, son las primeras hechas de mitocondrias con una resolución espacial relativamente alta de 90 nanómetros.
Durante unos minutos, la estructura mitocondrial interna cambió drásticamente de varias maneras. Inicialmente, se observó el alargamiento y el aumento en el número de crestas. Una secuencia de imágenes muestra las membranas internas de las mitocondrias vecinas fusionándose, en otras palabras, dos mitocondriasfusionando para hacer uno. Otra secuencia de imágenes muestra dos crestas dentro de una mitocondria aparentemente fusionándose aparentemente. Se cree que el alargamiento y la creación de más crestas aumentan la eficiencia de la producción de energía síntesis de ATP al tiempo que protegen el mitocondrio de la "degradación autofagosomal" - un programadomuerte cuyo propósito es eliminar componentes innecesarios o disfuncionales de la célula y permitir la degradación ordenada y el reciclaje de componentes celulares.
Después del período inicial de alargamiento, las membranas internas de algunas mitocondrias se dividieron en glóbulos que se hincharon y perdieron cristales; algunos glóbulos se rompieron. Algunas formaron esferas concéntricas. La intensidad de fluorescencia se mantuvo igual. Cabe destacar aquí que los cristales y las membranas permanecen comoImagen nítida como antes, lo que indica que la causa de la muerte de la mitocondria no es la toxicidad debido a la degradación de la molécula marcadora debajo del haz. El láser STED extremadamente fuerte podría haber dañado las mitocondrias, aunque se desconoce exactamente por qué se rompen.
En estas imágenes, después de ver las respuestas iniciales de supervivencia, estamos observando la muerte de las mitocondrias bajo el intenso haz STED. Una futura dirección de investigación será reducir la intensidad del haz láser STED creando una molécula marcadora fluorescente que brille cuandoiluminado por la luz de una longitud de onda más larga y, por lo tanto, menor energía. Las mitocondrias podrían vivir más tiempo.
Sin embargo, incluso con MitoPB Yellow, el proceso de muerte, que no se comprende bien, puede estudiarse. Nadie sabe si los cambios morfológicos estructurales observados durante el proceso de muerte están relacionados con la apoptosis muerte normal y controlada onecrosis muerte por lesión o mal funcionamiento. Se sabe que la apoptosis se desencadena por una molécula de señalización llamada citocromo C: si se puede encontrar un reactivo que suprima el citocromo C, entonces las mitocondrias y las células humanas podrían vivir más tiempo.
Poder ver los procesos que ocurren dentro de las mitocondrias debería conducir a una mejor forma de diagnosticar la enfermedad mitocondrial humana, y tal vez incluso a una cura.
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Materiales proporcionados por Universidad de Nagoya . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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