En tan solo ocho años, CRISPR-Cas9 se ha convertido en el editor de genoma de referencia tanto para la investigación básica como para la terapia génica. Pero CRISPR-Cas9 también ha generado otras herramientas de manipulación de ADN potencialmente poderosas que podrían ayudar a corregir las mutaciones genéticas responsables de enfermedades hereditarias.
Investigadores de la Universidad de California, Berkeley, obtuvieron la primera estructura 3D de una de las herramientas más prometedoras: los editores de base, que se unen al ADN y, en lugar de cortar, reemplazan con precisión un nucleótido por otro.
Creados por primera vez hace cuatro años, los editores de bases ya se están utilizando en intentos de corregir mutaciones de un solo nucleótido en el genoma humano. Los editores de bases ahora disponibles podrían abordar aproximadamente el 60% de todas las enfermedades genéticas conocidas, potencialmente más de 15,000 trastornos hereditarios.- causado por una mutación en un solo nucleótido.
La estructura 3D detallada, informada en la edición del 31 de julio de la revista ciencia , proporciona una hoja de ruta para ajustar los editores básicos para hacerlos más versátiles y controlables para su uso en pacientes.
"Pudimos observar por primera vez a un editor de base en acción", dijo el becario postdoctoral de UC Berkeley Gavin Knott. "Ahora podemos comprender no solo cuándo funciona y cuándo no, sino también diseñar la próxima generaciónde editores de base para hacerlos aún mejores y más apropiados desde el punto de vista clínico ".
Un editor de base es un tipo de proteína de fusión Cas9 que emplea un Cas9 parcialmente desactivado sus tijeras de corte están deshabilitadas para que corte solo una hebra de ADN y una enzima que, por ejemplo, activa o silencia un gen,o modifica áreas adyacentes de ADN. Debido a que el nuevo estudio informa la primera estructura de una proteína de fusión Cas9, podría ayudar a guiar la invención de muchas otras herramientas de edición de genes basadas en Cas9.
"De hecho, vemos por primera vez que los editores base se comportan como dos módulos independientes: tienes el módulo Cas9 que te da especificidad, y luego tienes un módulo catalítico que te proporciona la actividad", dijo Audrone Lapinaite, un exBecario postdoctoral de UC Berkeley que ahora es profesor asistente en la Universidad Estatal de Arizona en Tempe. "Las estructuras que obtuvimos de este editor base vinculado a su objetivo realmente nos dan una forma de pensar acerca de las proteínas de fusión Cas9, en general, dándonos ideas sobre qué regiónde Cas9 es más beneficioso para fusionar otras proteínas ".
Lapinaite y Knott, que recientemente aceptaron un puesto como investigador en la Universidad de Monash en Australia, son los primeros coautores del artículo.
Editando una base a la vez
En 2012, los investigadores mostraron por primera vez cómo rediseñar una enzima bacteriana, Cas9, y convertirla en una herramienta de edición de genes en todo tipo de células, desde bacterianas hasta humanas. La creación de la bioquímica de UC Berkeley Jennifer Doudna y su colega francés,Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 ha transformado la investigación biológica y ha llevado la terapia génica a la clínica por primera vez en décadas.
Los científicos rápidamente eligieron Cas9 para producir una gran cantidad de otras herramientas. Básicamente, una combinación de proteínas y ARN, Cas9 apunta con precisión a un tramo específico de ADN y luego lo corta con precisión, como un par de tijeras. La función de tijeras puedeSin embargo, puede romperse, lo que permite que Cas9 se dirija y se una al ADN sin cortar. De esta manera, Cas9 puede transportar diferentes enzimas a regiones específicas del ADN, lo que permite que las enzimas manipulen genes
En 2016, David Liu de la Universidad de Harvard combinó un Cas9 con otra proteína bacteriana para permitir el reemplazo quirúrgicamente preciso de un nucleótido con otro: el primer editor de base.
Si bien el editor de bases de adenina inicial era lento, la versión más reciente, llamada ABE8e, es increíblemente rápida: completa casi el 100% de las ediciones de base previstas en 15 minutos. Sin embargo, ABE8e puede ser más propenso a editar fragmentos de ADN no deseados en untubo de ensayo, creando potencialmente lo que se conoce como efectos fuera del objetivo.
La estructura recientemente revelada se obtuvo con una técnica de imágenes de alta potencia llamada microscopía crioelectrónica cryoEM. Los ensayos de actividad mostraron por qué ABE8e es propenso a crear más ediciones fuera del objetivo: la proteína desaminasa fusionada con Cas9 siempre está activa.Cas9 salta alrededor del núcleo, se une y libera cientos o miles de segmentos de ADN antes de encontrar su objetivo deseado. La desaminasa adjunta, como un cañón suelto, no espera una combinación perfecta y, a menudo, edita una base antes de que Cas9 se detenga.en su objetivo final.
Saber cómo están vinculados el dominio efector y Cas9 puede conducir a un rediseño que activa la enzima solo cuando Cas9 ha encontrado su objetivo.
"Si realmente desea diseñar una proteína de fusión verdaderamente específica, debe encontrar una manera de hacer que el dominio catalítico sea más parte de Cas9, de modo que detecte cuando Cas9 está en el objetivo correcto y solo entonces se active, en su lugarde estar activo todo el tiempo ", dijo Lapinaite.
La estructura de ABE8e también señala dos cambios específicos en la proteína desaminasa que hacen que funcione más rápido que la versión anterior del editor base, ABE7.10. Esas dos mutaciones puntuales permiten que la proteína se adhiera al ADN con más fuerza y reemplace A de manera más eficientecon G.
"Como biólogo estructural, realmente quiero mirar una molécula y pensar en formas de mejorarla racionalmente. Esta estructura y la bioquímica que la acompaña realmente nos dan ese poder", agregó Knott. "Ahora podemos hacer predicciones racionales de cómo estoel sistema se comportará en una celda, porque podemos verlo y predecir cómo se romperá o predecir formas de mejorarlo ".
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Universidad de California - Berkeley . Original escrito por Robert Sanders. Nota: el contenido se puede editar por estilo y longitud.
Referencia de la revista :
cite esta página :