Por primera vez, los investigadores han tratado un modelo animal de un trastorno genético utilizando un vector viral para administrar componentes de edición del genoma en los que se ha corregido la mutación causante de la enfermedad. La entrega del vector a ratones recién nacidos mejoró su supervivencia durante el tratamientode animales adultos, inesperadamente, los empeoró, según un nuevo estudio realizado por investigadores de la Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania. El equipo publicó sus hallazgos en Biotecnología de la naturaleza .
"Corregir una mutación que causa la enfermedad después del nacimiento en este modelo animal nos acerca un paso más a la realización del potencial de la medicina personalizada", dijo el autor principal James Wilson, MD, PhD, profesor de Medicina y director del Centro de Enfermedades Huérfanasen Penn. "Sin embargo, mi carrera de 35 años en terapia génica me ha enseñado lo difícil que puede ser traducir estudios de ratones a tratamientos humanos exitosos. De este estudio, ahora estamos ajustando el sistema de edición de genes en las próximas fases de nuestra investigación paraabordar las complicaciones imprevistas que se observan en animales adultos ". Wilson también es director del Programa Penn Gene Therapy.
El laboratorio de Wilson se centró en el hígado como objetivo para la edición de genes, ya que habían resuelto el problema de la administración de genes en este órgano en trabajos previos usando la terapia génica tradicional usando vectores basados en virus adenoasociados AAV. Sin embargo, la terapia de reemplazo génicocon AAV no es ideal para tratar enfermedades genéticas del hígado que se manifiestan como recién nacidos ya que el genoma no integrante se pierde a medida que proliferan las células hepáticas en desarrollo.
Debido a esto, Wilson, coautora principal, Lili Wang, PhD, profesora asociada de investigación de Patología y Medicina de Laboratorio, y sus colaboradores, pensó que el hígado del recién nacido podría ser un órgano ideal para la corrección génica mediada por AAV usando CRISPR-Cas9,una tecnología de edición del genoma guiada por ARN que utiliza la proteína bacteriana Cas9. Con CRISPR-Cas9, la mutación corregida persistirá a medida que se pierda el genoma del vector.
Esta hipótesis se probó en un modelo de ratón de un trastorno metabólico raro del ciclo de la urea causado por una deficiencia en una enzima llamada ornitina transcarbamilasa OTC. El ciclo de la urea es una serie de seis enzimas hepáticas que ayudan a eliminar el amoníaco del cuerpo,un producto de descomposición del metabolismo de las proteínas. Cuando una de estas enzimas falta o es deficiente, el amoníaco se acumula en la sangre y viaja al cerebro, causando una multitud de problemas, que incluyen daño cerebral y muerte.
La deficiencia de OTC es el más común de los trastornos del ciclo de la urea, que ocurre en uno de cada 40,000 nacimientos. Un gen OTC mutado puede causar una enzima que es más corta de lo normal, tiene una forma incorrecta o puede no producirse en absoluto.La mutación genética responsable de la OTC se produce en el cromosoma X, por lo que las mujeres suelen ser portadoras, mientras que sus hijos con el gen mutado sufren la enfermedad.
cortar y pegar
El equipo inyectó dos AAV específicamente un serotipo AAV8 descubierto en el laboratorio de Wilson que tiene afinidad por las células hepáticas, uno que expresa Cas9 y el otro que expresa un ARN guía y un ADN donante, en ratones recién nacidos con deficiencia de OTC.
Un AAV transportó la enzima Cas9 a través de un promotor específico del hígado para asegurarse de que solo se expresa en las células del hígado cuando se inyecta en la sangre. El otro AAV en el sistema dual transportó un ARN guía, una cadena de bloques de construcción genética de 20 basesseguido de otra secuencia para conducir la enzima Cas9 al lugar correcto dentro del ADN en el núcleo de la célula hepática. El segundo AAV también contenía una plantilla de ADN donante para corregir la mutación para que la célula pueda producir la proteína OTC normal.La adición de este ADN donante para corregir realmente una mutación distingue este estudio de otros hallazgos recientes de investigación de edición del genoma que eluden una mutación eliminando una porción del gen normal.
Todo este sistema de corrección es básicamente una función de "Cortar y Pegar", con la última parte de la fase de "Pegar" que depende del mecanismo de reparación del ADN de las células para unir correctamente el gen OTC nuevamente.
En los ratones recién nacidos, la inyección del sistema AAV revirtió la mutación en el 10 por ciento de las células hepáticas, en promedio, según lo medido por la presencia de la enzima OTC en las células hepáticas. También vieron una mayor supervivencia en los ratones jóvenes desafiados con undieta alta en proteínas, que empeora los síntomas deficientes de OTC en los ratones.
En contraste, más del 30 por ciento de los ratones deficientes en OTC no tratados murieron después de una semana y sus niveles de amoníaco fueron significativamente más altos que los ratones OTC cuyos genes fueron corregidos. La secuenciación profunda del ADN aislado de las células hepáticas en los ratones tratados también mostróesa corrección a la mutación fue consistente con los resultados de supervivencia.
Por otro lado, la corrección génica en ratones adultos con deficiencia de OTC de ocho a diez semanas de edad fue menor usando el mismo sistema dual de AAV. Los adultos también mostraron una disminución de la tolerancia a las proteínas y la hiperamonía letal en una dieta de comida normalDespués de tres semanas, los ratones adultos con una dosis baja de la corrección genética comenzaron a morir, y en contra de la intuición, los ratones que recibieron una dosis alta comenzaron a morir nueve días después de la inyección.
"Nos sorprendieron estos resultados, pero después de algunas investigaciones adicionales desciframos el mecanismo por el cual la edición de genes empeoraba la condición de los animales adultos", dijo Wang. Al observar la secuencia de ADN en las células del hígado en ratones adultos, descubrieron quela frecuencia de las células que tenían una función de Pasta corregida fue de solo un uno por ciento. "Esto ciertamente no fue suficiente para ayudar a estos ratones adultos", señaló Wang. Lo que era más problemático y completamente inesperado es que muchos de los genes no corregidos contenían grandesdeleciones que eliminaron la actividad residual del gen OTC mutante.
El primer paso para corregir el gen es la creación de una ruptura en el ADN por parte de Cas9 cerca de la mutación el corte que, en presencia del ADN del donante, prepara el escenario para la corrección de la mutación en lo quedenominada reparación dirigida por homología HDR o la pasta. "Parece que HDR es más eficiente en las células hepáticas del recién nacido que en las células adultas del hígado", dijo Wilson.
En ausencia de HDR, la célula reparará el corte usando otro proceso llamado unión final no homóloga NHEJ que deja a su paso pequeñas inserciones o deleciones. El equipo dirigió el corte a una parte del gen OTC que, siperturbado por una pequeña inserción o eliminación, no interferiría con la función residual del gen OTC mutante. Este fue el caso en ratones recién nacidos.
El equipo aprendió, sin embargo, que el NHEJ en las células hepáticas adultas dio como resultado deleciones mucho mayores, algunas de las cuales eliminaron cualquier función residual del gen OTC. El resultado neto de tasas bajas de la Pasta con respuestas al Corte que destruyeron el restoLa función del gen en muchas células resultó en una menor tolerancia a la proteína en ratones adultos.
"Las consecuencias negativas de la edición de genes observadas en ratones OTC adultos se limitan al tratamiento de enfermedades genéticas en las que la mutación disminuye pero no elimina la función", explicó Wilson. En un intento por evitar este problema en ciertos pacientes adultos con enfermedades hepáticas,el equipo está explorando métodos para crear el Corte sin incitar a las grandes eliminaciones y, al mismo tiempo, generar frecuencias más altas del Pegado.
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Materiales proporcionado por Facultad de medicina de la Universidad de Pensilvania . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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