Un equipo de investigadores del Hospital General de Massachusetts MGH ha demostrado que un método que desarrollaron para mejorar la utilidad y la precisión de la forma más común de las herramientas de edición de genes Las nucleasas guiadas por ARN CRISPR-Cas9 pueden aplicarse a las enzimas Cas9 deotras fuentes bacterianas. En un documento que recibe una publicación anticipada en línea en Biotecnología de la naturaleza , el equipo informa que evolucionó una variante de SaCas9: la enzima Cas9 de la Streptococcus aureus bacterias: que reconoce una gama más amplia de secuencias de nucleótidos, lo que permite la selección de sitios genómicos previamente inaccesibles para la tecnología CRISPR-Cas9.
"El desarrollo de variantes de Cas9 con un rango de focalización más amplio es particularmente importante para aplicaciones que requieren una focalización precisa de secuencias genómicas", dice Benjamin Kleinstiver, PhD, investigador de la Unidad de Patología Molecular MGH y autor principal y co-corresponsal del Biotecnología de la naturaleza papel. "Además, la secuencia de codificación de SaCas9 es un 23 por ciento más pequeña que la de SpCas9, la versión derivada de Streptococcus pyogenes - una diferencia de tamaño que hace que SaCas9 sea ventajoso para posibles aplicaciones terapéuticas que requieren la administración por virus "
Las nucleasas CRISPR-Cas9 se componen de una molécula de ARN corta, 20 nucleótidos de los cuales coinciden con la secuencia de ADN objetivo, y una enzima bacteriana Cas9 que corta el ADN en la ubicación deseada. Junto con la coincidencia entre las secuencias de ARN y ADN, Cas9necesita reconocer una secuencia de nucleótidos adyacente llamada motivo adyacente protospacer PAM. En un estudio anterior informado a principios de este año en Nature, el equipo de MGH describió un sistema genético que les permitió evolucionar rápidamente SpCas9 para reconocer diferentes secuencias de PAM.El SpCas9 que se produce reconoce una secuencia PAM de la forma NGG, en la que N significa cualquier nucleótido y G es una molécula de guanina, el equipo de MGH pudo desarrollar versiones de SpCas9 que reconocen un rango más amplio de secuencias PAM, esencialmente duplicando el rango desitios orientables.
En su estudio actual, el equipo de MGH recurrió a SaCas9, que naturalmente requiere la secuencia PAM NNGRRT, en la que R puede ser adenina o guanina y T debe ser timina, adyacente a su ADN objetivo. Usando una forma avanzada deEn el sistema de evolución molecular descrito en el informe anterior, el equipo de MGH logró desarrollar una variante que llaman KKH SaCas9 que reconoce las secuencias PAM con cualquier nucleótido en la tercera posición, aumentando su rango de focalización de dos a cuatro veces.diseñe estos cambios en la especificidad de PAM sin requerir un conocimiento avanzado de la estructura precisa de la enzima SaCas9, algo que se desconocía en el momento en que se realizaba este estudio.
"Ahora hemos demostrado que nuestro enfoque de evolución dirigida se puede utilizar para modificar la especificidad PAM de SaCas9, ampliando en gran medida el número de sitios genómicos a los que puede acceder esta importante nucleasa Cas9", dice J. Keith Joung, MD, PhD, jefe asociado de Investigación en el Departamento de Patología de MGH y co-corresponsal del Biotecnología de la naturaleza papel. "La capacidad de apuntar con precisión a los sitios es importante para los investigadores interesados en alterar pequeños elementos genéticos o realizar estudios que involucren la reparación del ADN por recombinación homóloga, un intercambio de nucleótidos entre cadenas de ADN, que se puede lograr mejor cuando la ruptura del ADN está cercaal sitio de interés. Creemos que nuestro enfoque de evolución dirigida proporciona un plan importante para alterar las propiedades de reconocimiento de la riqueza de nucleasas Cas9 que existen en muchas bacterias ". Joung es profesor de Patología en la Facultad de Medicina de Harvard
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Materiales proporcionados por Hospital General de Massachusetts . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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