Una nueva versión de ingeniería de la nucleasa CRISPR-Cas9 de edición de genes parece abolir enérgicamente las rupturas de ADN no deseadas y fuera del objetivo que son una limitación actual significativa de la tecnología, reduciéndolas a niveles indetectables. En su informe que recibe una publicación anticipada en líneaen Naturaleza investigadores del Hospital General de Massachusetts MGH describen cómo la alteración de la enzima Cas9 para reducir las interacciones no específicas con el ADN objetivo puede ampliar en gran medida las aplicaciones de la tecnología de edición de genes.
"Nuestra creación de una variante Cas9 que lleva los efectos fuera del objetivo a niveles en los que ya no podemos detectarlos, incluso con los métodos más sensibles, proporciona un avance sustancial para las aplicaciones terapéuticas en las que desea alcanzar su objetivo con precisión sin causardaño en cualquier otro lugar del genoma ", dice J. Keith Joung, MD, PhD, jefe asociado de Investigación y Jim and Ann Orr MGH Research Scholar en el Departamento de Patología de MGH, autor principal de la Naturaleza papel. "Pero su impacto también será increíblemente importante para las aplicaciones de investigación porque los efectos fuera del objetivo pueden confundir los resultados de cualquier experimento. Como resultado, imaginamos que nuestra variante de alta fidelidad suplantará el uso de Cas9 estándar paramuchas aplicaciones de investigación y terapéuticas "
Utilizado para crear rupturas de ADN específicas en las que se pueden introducir cambios genéticos, las nucleasas CRISPR-Cas9 combinan una enzima bacteriana de corte de ADN llamada Cas9 con una secuencia corta de ARN guía que puede unirse a la secuencia de ADN objetivo. Aunque es más fácil de usar que antesLas herramientas de edición de genes, las nucleasas CRISPR-Cas9 tienen una limitación bien caracterizada y significativa. Como se describió en los estudios de 2013 dirigidos por Joung y otros, las nucleasas CRISPR-Cas9 pueden inducir roturas de ADN fuera del objetivo en sitios que se asemejan a la secuencia del objetivo.Las investigaciones posteriores realizadas por el equipo de Joung y otros han reducido, pero nunca han eliminado completa y consistentemente estos efectos fuera del objetivo.
Joung y sus colegas plantearon la hipótesis de que la reducción de las interacciones entre Cas9 y el ADN objetivo podría eliminar por completo los efectos fuera del objetivo mientras se conserva la interacción deseada en el objetivo. El equipo de MGH se centró en el hecho de que ciertas porciones de la enzima Cas9 puedeninteractuar con la columna vertebral de la molécula de ADN objetivo. Siguiendo una observación realizada originalmente por el coautor Vikram Pattanayak, MD, PhD, de MGH Pathology, el equipo alteró cuatro de estos contactos mediados por Cas9 reemplazando las largas cadenas laterales de aminoácidosque se unen a la columna vertebral del ADN con los más cortos que no pueden hacer esas conexiones. "Nuestro trabajo anterior sugirió que Cas9 podría unirse a su sitio de ADN objetivo deseado con más energía de la que necesita, permitiendo la escisión no deseada de sitios fuera del objetivo imperfectamente emparejados", dicePattanayak ". Razonamos que, al hacer sustituciones en estas cuatro posiciones, podríamos eliminar parte de esa energía para eliminar los efectos fuera del objetivo y al mismo tiempo conservar todo el target activities "
El coautor principal, Benjamin Kleinstiver, PhD, de la Unidad de Patología Molecular MGH y Michelle Prew, una técnica de investigación en el laboratorio de Joung, probaron las 15 variantes posibles en las cuales cualquier combinación de uno, dos, tres o cuatro de esos aminoácidosSe alteraron las cadenas laterales y se descubrió que una variante de tres sustituciones y una de cuatro sustituciones parecían mostrar la mayor promesa de discriminar contra los sitios objetivo no coincidentes, al tiempo que conservaban actividades completas en el objetivo en las células humanas.
Luego, los investigadores caracterizaron más completamente la variante de cuatro sustituciones, a la que llamaron SpCas9-HF1 Sp para la bacteria Streptococcus pyogenes, que es la fuente de esta Cas9 ampliamente utilizada, y HF para alta fidelidad.La variante indujo efectos sobre el objetivo comparables a los observados con el SpCas9 original inalterado cuando se usó con más del 85 por ciento de 37 ARN guía diferentes que probaron. Usando GUIDE-Seq, un sistema altamente sensible que el laboratorio de Joung desarrolló en 2014 para detectar CRISPR fuera del objetivo-Cas9 efectos en todo el genoma, el equipo encontró que, mientras que las nucleasas que combinan SpCas9 inalterado con siete ARN guía diferentes indujeron hasta 25 mutaciones fuera del objetivo, el uso de SpCas9-HF1 no produjo efectos detectables fuera del objetivo con seis de esos ARN guíay solo un sitio fuera del objetivo con el séptimo. Estos resultados se confirmaron aún más mediante experimentos de secuenciación profunda dirigida.
El equipo de Joung también descubrió que SpCas9-HF1 podría reducir los efectos fuera del objetivo cuando se dirigen a sitios de ADN atípicos caracterizados por secuencias repetidas de uno o dos nucleótidos, sitios que generalmente están sujetos a muchas mutaciones fuera del objetivo. Desarrollaron derivados adicionales de SpCas9-HF1, llamado HF2, HF3 y HF4, que podría eliminar los pocos efectos residuales fuera del objetivo que persistieron con la variante HF1 y una pequeña cantidad de ARN guía. "Si SpCas9-HF1 usa un cierto ARN guía, todavía produce un puñadode los efectos fuera del objetivo que son particularmente difíciles de eliminar, es posible diseñar nuevas variantes que eliminen incluso esos efectos ", dice Joung, profesor de Patología en la Facultad de Medicina de Harvard.
Los investigadores también demostraron que SpCas9-HF1, como su contraparte natural, podría combinarse con otras alteraciones útiles que extiendan su utilidad. Trabajo previo del laboratorio de Joung publicado el verano pasado en Naturaleza había demostrado que la introducción de una serie de sustituciones de aminoácidos podría ampliar el rango de focalización de SpCas9 inalterado. En el estudio actual, los autores muestran que la introducción de estas mismas alteraciones en SpCas9-HF1 también extendió el rango de focalización de la variante de alta fidelidad."Estos resultados muestran que estas variantes deberían ser ampliamente útiles para cualquier persona que use actualmente la tecnología CRISPR-Cas9", dice Kleinstiver. "Se pueden usar fácilmente en lugar de SpCas9 de tipo salvaje y proporcionar un método altamente efectivo para reducir las mutaciones fuera del objetivoniveles indetectables "
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Materiales proporcionados por Hospital General de Massachusetts . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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