A pesar de las grandes esperanzas y la alta inversión en la edición del gen CRISPR-Cas9, los científicos aún tienen mucho que aprender sobre cómo funciona en humanos.
En el último ejemplo, Universidad de California, Berkeley, los científicos descubrieron que las suposiciones de las personas sobre cómo las células reparan el genoma después de que la enzima Cas9 corta el ADN están equivocadas.
El descubrimiento da una idea de por qué la edición del gen CRISPR-Cas9 funciona notablemente bien en casi todas las células intentadas, aunque no con el mismo éxito en todas las células. Y podría ayudar a los investigadores a aumentar la eficiencia con la que las células insertan nuevo ADN en el genoma.para reemplazar una mutación dañina con la secuencia de ADN correcta, por ejemplo, y en general ajustar la edición CRISPR-Cas9 para obtener el resultado deseado.
"Si desea tratar la anemia de células falciformes, sus posibilidades de éxito están indisolublemente ligadas a la eficiencia con la que puede reemplazar el gen mutado de células falciformes por el correcto", dijo Chris Richardson, investigador postdoctoral de UC Berkeley, primer autor de undocumento que describe los hallazgos. "Si recolecta un millón de células de un paciente y tiene una tasa de inserción del 10 por ciento, eso no es tan bueno como si tuviera del 30 al 40 por ciento. Ser capaz de manipular esas células para aumentar la frecuencia de este proceso, llamada reparación dirigida por homología, es emocionante ".
"La edición de genes es súper poderosa, con muchas promesas, pero, hasta ahora, mucha prueba y error. La forma en que funciona en las células humanas ha sido una caja negra con muchas suposiciones", dijo el autor principalJacob Corn, profesor adjunto de biología molecular y celular de la Universidad de California en Berkeley, "finalmente estamos empezando a tener una idea de lo que está sucediendo".
Corn, Richardson y sus colegas publicarán sus hallazgos en la edición de agosto de la revista Genética de la naturaleza.
Corn fue hasta hace poco el director científico de biomedicina en el Innovative Genomics Institute, un programa conjunto de investigación CRISPR entre UC Berkeley y UC San Francisco. Este otoño, se unirá a la facultad de ETH en Zurich, Suiza.
CRISPR se basa en la reparación del ADN
CRISPR-Cas9 es revolucionario debido a la precisión con la que se concentra en una secuencia de ADN específica de miles de millones en el genoma y escinde la molécula de ADN de doble cadena. Pero después de eso, depende de la célula reparar el daño.
La reparación puede ocurrir de dos maneras. Las enzimas pueden unir los extremos colgantes, lo que a menudo resulta en una o más bases, los bloques de construcción de ADN, que se agregan o eliminan, lo que interrumpe la función del gen. Alternativamente, otroslas enzimas pueden parchar la ruptura con una sola cadena de ADN que coincide con la secuencia de ADN aguas arriba y aguas abajo del corte. Se crea una cadena de ADN complementaria para completar la reparación de la doble cadena.
El primero, llamado unión final no homóloga, parece ser el resultado más común después del corte CRISPR. El segundo, la reparación dirigida por homología, ocurre con mayor frecuencia en algunos tipos de células que en otros, y requiere la presencia de una piezade ADN que se puede utilizar para parchar la ruptura. Los investigadores a menudo suministran una pieza de ADN de cadena sencilla y esperan que la célula la use para reemplazar la secuencia defectuosa por la nueva.
Sin embargo, ambos procesos son un poco misteriosos y nadie sabe por qué algunas células se adhieren fácilmente al ADN mientras que otras lo hacen con poca frecuencia.
"El entusiasmo por usar CRISPR-Cas9 para aplicaciones de biología médica o sintética es genial, pero nadie sabe realmente qué sucede después de ponerlo en las células", dijo Richardson. "Se va y crea estos descansos y se cuenta con las célulaspara solucionarlos. Pero la gente realmente no entiende cómo funciona ese proceso "
Richardson y Corn emplearon una técnica llamada interferencia CRISPR CRISPRi para eliminar, de una en una, más de 2.000 genes conocidos o sospechosos de ser detectados, para descubrir qué enzimas de reparación de ADN son críticas para la reparación dirigida por homología después del corte CRISPR.involucrado en la reparación del ADN, una función crítica para una célula sana.
Sorprendentemente, muchos de los genes que resultaron ser importantes la reparación dirigida por homología se redujo drásticamente cuando fueron silenciados estuvieron involucrados en un importante sistema de reparación que no se cree que esté involucrado en la reparación CRISPR.
anemia de Fanconi
La vía involucra 21 proteínas separadas y se denomina vía de anemia de Fanconi porque, si alguno de los genes de estas proteínas está dañado, las personas desarrollan anemia de Fanconi, una enfermedad hereditaria rara pero grave en la cual la médula ósea no puede producir suficientes células sanguíneas nuevasSe asocia con defectos congénitos y un alto riesgo de cáncer, incluida una probabilidad del 10 por ciento de desarrollar leucemia en la infancia. Pocos pacientes viven más allá de los 30 años de edad.
La vía se conoce y estudia desde hace décadas, pero se entendió en gran medida que repara un tipo específico de daño en el ADN: los enlaces cruzados entre cadenas, donde un nucleótido en una cadena de ADN se une estrechamente con un nucleótido en la cadena adyacente, interfiriendo conReplicación del ADN y, a menudo, matar la célula. Los investigadores en la década de 1980 habían informado una conexión entre la reparación dirigida por homología y la vía de la anemia de Fanconi, pero se había ignorado o malentendido, señaló Corn.
"Según nuestro trabajo, creemos que la vía de la anemia de Fanconi también juega un papel importante en la reparación de otros tipos de lesiones, pero se entiende mejor como la vía que repara las roturas de doble cadena", dijo Richardson. "Después de la edición de Cas9, la vía de la anemia de Fanconi es necesaria si desea insertar un nuevo ADN "
Sin embargo, la importancia de la vía de la anemia de Fanconi en la reparación de roturas CRISPR pone en duda algunos tratamientos CRISPR planificados para la enfermedad misma. Sin una vía activa de la anemia de Fanconi, las células podrían no ser capaces de reemplazar sus genes mutados con genes normales después de que Cas9un corte.
De hecho, el nivel de actividad de la vía de la anemia de Fanconi puede afectar la eficacia con la que CRISPR puede insertar ADN en una célula específica. Los investigadores concluyeron que, si bien la unión final es el mecanismo de reparación predeterminado después de una ruptura de doble cadena, el Fanconila vía de la anemia compite con ella, y esa mayor actividad da como resultado una reparación más dirigida por la homología y menos unión final.
tratamientos contra el cáncer
Si bien los hallazgos ayudan a los científicos a comprender mejor los mecanismos de reparación del ADN en las células humanas, también podrían ayudar a los investigadores a desarrollar terapias contra el cáncer dirigidas a la reparación del ADN en las células cancerosas. Debido a que ahora otros factores parecen estar involucrados en la reparación de la doble cadenarompe, esta investigación amplía la lista de proteínas que podrían estar mal reguladas para arruinar la reparación del ADN en las células cancerosas y hacerlas más susceptibles a la muerte.
Richardson también descubrió que una de las 21 proteínas en la vía, FANCD2, siempre se aloja en el sitio de la ruptura de doble cadena creada por CRISPR-Cas9, lo que indica que juega un papel importante en la regulación de la inserción de nuevo ADN en elgenoma en el sitio de corte. FANCD2 podría modificarse para aumentar la frecuencia con la que una célula inserta ADN a través de la reparación dirigida por homología.
"Además, dado que FANCD2 se localiza en el sitio de las interrupciones de Cas9, puede usar FANCD2 para asignar dónde está cortando Cas9 en cualquier tipo de célula", dijo Richardson. "Si edita una población de células y desea saber dónde está activado- y los cortes fuera del objetivo son, puede simplemente mapear dónde se encontró FANCD2 en el genoma y puede encontrar los cortes ".
"Toda la vía de la anemia de Fanconi afecta el equilibrio entre la unión final y la reparación dirigida por homología; actúa como un policía de tránsito", dijo Corn. "Por lo tanto, el genotipo de un paciente afectará la forma en que se edita el gen".
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Materiales proporcionados por Universidad de California - Berkeley . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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