Utilizando una actividad insospechada de la proteína CRISPR-Cas12a, los investigadores crearon un sistema de diagnóstico simple llamado DETECTR para analizar células, sangre, saliva, orina y heces para detectar mutaciones genéticas, cáncer y resistencia a los antibióticos y también diagnosticar infecciones bacterianas y virales.Los científicos descubrieron que cuando Cas12a se une a su objetivo de ADN bicatenario, mastica indiscriminadamente todo el ADN monocatenario y luego crean moléculas indicadoras unidas al ADN monocatenario para señalar cuándo Cas12a encuentra su objetivo.
CRISPR-Cas12a, una de las proteínas de corte de ADN que revoluciona la biología en la actualidad, tiene un efecto secundario inesperado que la convierte en una enzima ideal para diagnósticos de enfermedades simples, rápidos y precisos.
Cas12a, descubierto en 2015 y originalmente llamado Cpf1, es como la conocida proteína Cas9 que Jennifer Doudna de UC Berkeley y su colega Emmanuelle Charpentier convirtieron en una poderosa herramienta de edición de genes en 2012.
CRISPR-Cas9 ha sobrealimentado la investigación biológica en solo seis años, acelerando la exploración de las causas de la enfermedad y generando muchas nuevas terapias potenciales. Cas12a fue una importante adición a la caja de herramientas de corte de genes, capaz de cortar ADN bicatenario enlugares que Cas9 no puede y, debido a que deja bordes irregulares, quizás sea más fácil de usar al insertar un nuevo gen en el corte de ADN.
Pero los coprimeros autores Janice Chen, Enbo Ma y Lucas Harrington en el laboratorio de Doudna descubrieron que cuando Cas12a se une y corta una secuencia de ADN bicatenaria dirigida, desata inesperadamente el corte indiscriminado de todo el ADN monocatenario en un tubo de ensayo.
La mayor parte del ADN en una célula tiene la forma de una hélice bicatenaria, por lo que esto no es necesariamente un problema para las aplicaciones de edición de genes. Pero sí permite a los investigadores usar una molécula "reportera" de una sola cadena con elProteína CRISPR-Cas12a, que produce una señal fluorescente inequívoca cuando Cas12a ha encontrado su objetivo.
"Seguimos fascinados por las funciones de los sistemas CRISPR bacterianos y cómo la comprensión mecanicista conduce a oportunidades para nuevas tecnologías", dijo Doudna, profesor de biología molecular y celular y de química e investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Los investigadores de UC Berkeley, junto con sus colegas de UC San Francisco, publicarán sus hallazgos el 15 de febrero a través de la revista ciencia servicio de vía rápida, primer lanzamiento
Los investigadores desarrollaron un sistema de diagnóstico que denominaron DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter, o DETECTR, para la detección rápida y fácil en el punto de atención, incluso de pequeñas cantidades de ADN en muestras clínicas. Implica agregar todos los reactivos en una sola reacción: CRISPR-Cas12a y su secuencia dirigida al ARN ARN guía, la molécula informadora fluorescente y un sistema de amplificación isotérmica llamada amplificación de la polimerasa recombinasa RPA, que es similar a la reacción en cadena de la polimerasa PCR. Cuando se calienta a la temperatura corporal, el RPA se multiplica rápidamentela cantidad de copias del ADN objetivo, lo que aumenta las posibilidades de que Cas12a encuentre una de ellas, que una y libere el corte de ADN de una sola cadena, lo que da como resultado una lectura fluorescente.
Los investigadores de UC Berkeley probaron esta estrategia utilizando muestras de pacientes que contienen el virus del papiloma humano VPH, en colaboración con el laboratorio de Joel Palefsky en la Universidad de California en San Francisco. Utilizando DETECTR, pudieron demostrar la detección precisa de los tipos de VPH de "alto riesgo"16 y 18 en muestras infectadas con muchos tipos diferentes de VPH.
"Esta proteína funciona como una herramienta robusta para detectar el ADN de una variedad de fuentes", dijo Chen. "Queremos superar los límites de la tecnología, que es potencialmente aplicable en cualquier situación de diagnóstico de punto de atención donde hayaun componente de ADN, que incluye cáncer y enfermedades infecciosas "
El corte indiscriminado de todo el ADN monocatenario, que los investigadores descubrieron es cierto para todas las moléculas Cas12 relacionadas, pero no para Cas9, puede tener efectos no deseados en las aplicaciones de edición del genoma, pero se necesita más investigación sobre este tema, dijo Chen.La transcripción de genes, por ejemplo, la célula crea brevemente cadenas individuales de ADN que Cas12a podría cortar accidentalmente.
La actividad de las proteínas Cas12 es similar a la de otra familia de enzimas CRISPR, Cas13a, que mastica el ARN después de unirse a una secuencia de ARN objetivo. Varios equipos, incluidos los de Doudna, están desarrollando pruebas de diagnóstico con Cas13a que podrían, por ejemplo, detectar el genoma de ARN del VIH.
Estas nuevas herramientas han sido reutilizadas de su papel original en los microbios, donde sirven como sistemas inmunes adaptativos para defenderse de las infecciones virales. En estas bacterias, las proteínas Cas almacenan registros de infecciones pasadas y usan estos "recuerdos" para identificar ADN dañino durante las infeccionesCas12a, la proteína utilizada en este estudio, corta el ADN invasor, evitando que las bacterias sean absorbidas por el virus.
El descubrimiento casual del comportamiento inusual de Cas12a resalta la importancia de la investigación básica, dijo Chen, ya que proviene de una curiosidad básica sobre el mecanismo que Cas12a usa para escindir el ADN de doble cadena.
"Es genial que, al abordar la cuestión del mecanismo de escisión de esta proteína, descubrimos lo que creemos que es una tecnología muy poderosa útil en una variedad de aplicaciones", dijo Chen.
Los coautores adicionales del artículo son la estudiante de pregrado Xinran Tian de UC Berkeley y Maria Da Costa y Joel Palefsky de UCSF. El trabajo fue apoyado principalmente por la National Science Foundation.
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Materiales proporcionado por Universidad de California - Berkeley . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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