CRISPR / Cas9 es ahora un nombre familiar asociado con estudios de ingeniería genética. A través de la investigación de vanguardia descrita en su artículo publicado en Informes científicos , un equipo de investigadores de la Universidad de Ciencias de Tokio, la Universidad de Meiji y la Universidad de Agricultura y Tecnología de Tokio, dirigido por el Dr. Takayuki Arazoe y el profesor Shigeru Kuwata, ha establecido recientemente una serie de estrategias novedosas para aumentar la eficiencia de la disrupción genética dirigiday nueva "introducción" de genes usando el sistema CRISPR / Cas9 en el hongo de la explosión del arroz Pyricularia Magnaporthe oryzae . Estas estrategias incluyen la introducción más rápida de un solo paso del gen, el uso de pequeñas secuencias homólogas y la omisión de ciertos "patrones" de ADN del huésped y la modificación de los componentes del huésped.
El equipo dirigido por el Dr. Arazoe y el Prof. Kuwata ha ideado técnicas simples y rápidas para la edición de genes disrupción de genes objetivo, sustitución de secuencias y reintroducción de genes deseados usando CRISPR / Cas9 en el hongo de la explosión de arroz Pyricularia Magnaporthe oryzae , un tipo de hongo filamentoso. Estimulados por resultados alentadores, los investigadores suponen: "Las plantas y sus agentes patógenos aún tienen coevolución en la naturaleza. Explotar los mecanismos de mutación de hongos patógenos modelo como una técnica de edición del genoma podría conducir al desarrollo de mástécnicas novedosas en ingeniería genética "
El componente de trabajo del sistema CRISPR / Cas9 se une a la región del gen diana ADN y provoca una ruptura de doble cadena específica del sitio DSB en el ADN. La unión efectiva de este componente requiere un cierto "motivo" o "patrón "llamado el motivo adyacente protospacer PAM, que sigue corriente abajo de la región del gen objetivo.
La mayoría de las técnicas de edición del genoma requieren DSB inducidos en el sitio objetivo, lo que desencadena las vías de "reparación" de ADN en el huésped. La recombinación homóloga HR es un mecanismo para la reparación de DSB, y es útil porque agrega secuencias complementarias. Sin embargo,la metodología subyacente es laboriosa, y su eficiencia convencionalmente depende de factores externos tales como las propiedades del huésped y los PAM. La FC puede dividirse en dos vías: tipo "no cruzado" conversión de genes y "cruzado". Las reparaciones de tipo cruzado sonse sabe que ocurre en las células que sufren meiosis. Sin embargo, la comprensión de su papel en las células que sufren mitosis es limitada, y dicha información sobre los hongos filamentosos no está disponible. Es esta brecha en el conocimiento lo que los investigadores estaban tratando de abordar.
En su estudio, los investigadores crearon primero un vector sistema de administración de genes basado en CRISPR / Cas9 para confirmar la frecuencia cardíaca de tipo cruzado en la región del gen receptor en el hongo de la explosión del arroz.
Luego, para verificar la orientación del gen o la "sustitución de secuencia", crearon un vector "mutante", optimizado para la FC de tipo crossover único, para la disrupción dirigida del gen huésped que codifica la deshidratasa de la esctalona SDH, una proteína involucrada en la melaninaEste vector se introdujo en el vector que contiene el gen de la higromicina B fosfotransferasa hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina B. Los investigadores especularon que la HR de tipo cruzado único insertaría todo el vector junto con hph en el objetivoLos mutantes con el gen SDH alterado serían identificados como colonias blancas debido a la pérdida de melanina en un medio que contiene higromicina B. Los investigadores encontraron que el número de colonias blancas resistentes a la higromicina B aumentó dramáticamente al usar el vector CRISPR / Cas9, lo que significa que el sistema CRISPR / Cas9 es eficaz en la inducción de HR de tipo crossover único. El mayor beneficio de esta técnica es que necesita una secuencia homóloga extremadamente cortances 100 pares de bases;que es realmente pequeño en biología molecular.
Los investigadores también usaron una estrategia similar para verificar si la introducción de genes o "knock in" es posible a través de la frecuencia cardíaca de tipo cruzado simple usando un vector CRISPR / Cas9. Usaron el gen de la proteína verde fluorescente GFP, que esampliamente utilizado como gen "informador" para hacer que las células huésped brillen de color verde fluorescente cuando se insertan en su genoma. Especulaban que el HR cruzado único daría lugar a la introducción de GFP en la secuencia del receptor. De hecho, descubrieron que el uso del vector CRISPR / Cas9dieron lugar a colonias verdes fluorescentes en medio de higromicina Estos hallazgos muestran que el sistema CRISPR / Cas9 se puede utilizar para la generación eficiente de genes en "un solo paso".
Esta investigación apunta a un hecho sorprendente de que, tal vez, los PAM no son tan necesarios para la edición del gen CRISPR / Cas9 en hongos. Al elogiar el éxito de la investigación, el equipo afirma: "Hemos descubierto que los hongos filamentosos tienen características genómicas únicas., donde los cruces se inducen con frecuencia, incluso en las células somáticas, al escindir el ADN objetivo. Utilizamos estas características para interrumpir el ADN objetivo e introducir genes "informadores". También logramos aumentar la eficiencia y la velocidad del knock-in,utilizando un proceso de un solo paso. Esta tecnología supera la restricción planteada por los PAM, que es una de las mayores desventajas del sistema CRISPR / Cas9, y permite una edición del genoma más flexible, lo que ha sido difícil en estudios anteriores sobre hongos filamentosos."
Finalmente, cuando se le preguntó sobre las aplicaciones más amplias de esta investigación, el Dr. Arazoe y el Prof. Kuwata declararon elocuentemente: "El hongo de la explosión del arroz es un patógeno importante que causa la enfermedad destructiva del arroz, que es el alimento básico del país. El CRISPR / Cas9La técnica de edición del genoma basada en nuestro estudio puede acelerar la investigación de la biología molecular de este patógeno, contribuyendo en última instancia al suministro estable de alimentos y a la seguridad alimentaria basada en plantas. Además, esta técnica es aplicable a otros hongos filamentosos ampliamente utilizados en la industria, especialmente enlas industrias de bioprocesamiento, alimentación y fermentación "
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Materiales proporcionados por Universidad de Ciencias de Tokio . Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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