Por toda la atención que ha recibido el microbioma humano en los últimos años, un aspecto de dicha investigación rara vez aparece en los titulares: la dificultad de observar cómo cambia con el tiempo en respuesta a varios estímulos. El método de análisis más común es extraer bacteriasde muestras fecales y luego secuenciando sus genomas, pero este enfoque, aunque mínimamente invasivo, pierde información crucial sobre dónde y cuándo se producen cambios bacterianos en el intestino, lo que proporciona a los científicos una imagen incompleta de la dinámica del microbioma.
Ahora, una nueva herramienta creada por investigadores del Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en la Universidad de Harvard y la Escuela de Medicina de Harvard HMS proporciona una solución a este problema en forma de un conjunto de genes bacterianos que han sido diseñados para detectar yregistran cambios en el crecimiento de diferentes poblaciones de bacterias a lo largo del tiempo en las tripas de ratones vivos con precisión unicelular, y pueden servir como plataforma para diagnósticos y terapias complejas, basadas en biología sintética para una variedad de aplicaciones en el intestino.El estudio se publica en Comunicaciones de la naturaleza .
Manteniendo el tiempo
El sistema utiliza un circuito genético oscilante, denominado represor, como una especie de reloj genético para medir el crecimiento bacteriano. El represor consta de tres genes bacterianos que codifican tres proteínas tetR, cl y lacI, cada una de las cuales bloqueala expresión de una de las otras proteínas. Los genes están unidos en un circuito de retroalimentación negativa, de modo que cuando la concentración de una de las proteínas represoras cae por debajo de cierto nivel, la proteína que había estado reprimiendo se expresa, lo que bloquea la expresión dela tercera proteína, y el proceso se repite de manera cíclica.
Cuando los tres genes se insertan en un plásmido y se introducen en las bacterias, el número de ciclos de bucle de retroalimentación negativa completados puede servir como un registro de cuántas divisiones celulares han sufrido las bacterias. Cada vez que las bacterias se dividen, cualquier proteína represora presente ensu citoplasma se diluye, por lo que su concentración disminuye gradualmente y desencadena la expresión de la próxima proteína en el ciclo represor. Crucialmente, el ciclo represor se repite después de 15.5 generaciones bacterianas independientemente de qué tan rápido o lento crezcan las bacterias. Esto le permite actuar comouna medida objetiva del tiempo, como un reloj o un reloj.
"Imagínese si tuviera dos personas usando dos relojes diferentes, y el segundero del reloj de una persona se moviera dos veces más rápido que el de la otra persona", explicó el primer autor David Riglar, Ph.D., un ex postdoc en el WyssEl Instituto y el HMS que ahora lideran un grupo de investigación como Sir Henry Dale Fellow en el Imperial College de Londres. "Si detuvieran ambos relojes después de una hora, no estarían de acuerdo en qué hora era, porque su medición del tiempo varía según elvelocidad del movimiento de la segunda mano. En contraste, nuestro represor es como un reloj que siempre se mueve a la misma velocidad, así que no importa cuántas personas diferentes usen uno, todos darán una medida de tiempo constante. Esta calidad nos permiteestudie con mayor precisión el comportamiento de las bacterias en el intestino "
Los investigadores acoplaron cada una de las tres proteínas represoras a una molécula fluorescente de diferente color, y desarrollaron un flujo de trabajo de imágenes llamado RINGS Inferencia de crecimiento basada en represores a nivel de células individuales para rastrear qué proteína se expresa en diferentes puntos de tiempo durante elcrecimiento de las bacterias ". A medida que una colonia bacteriana crece hacia afuera, el circuito represor crea estas diferentes firmas fluorescentes, similares a anillos de árboles, en función de qué proteína represora estaba activa en la bacteria única que inició la colonia", dijo Riglar.los anillos fluorescentes registran cuántos ciclos represores se han producido desde que comenzó el crecimiento, y podemos analizar ese patrón para estudiar cómo varían las tasas de crecimiento entre diferentes bacterias y en diferentes ambientes ".
Utilizando RINGS, el equipo pudo rastrear con éxito las divisiones celulares en varias especies bacterianas diferentes cultivadas in vitro, y observó que la duración del ciclo represor de la bacteria se mantuvo constante cuando se cultivaron en muestras extraídas de intestino de ratón para simular un complejomicroambiente o expuesto a un antibiótico para simular condiciones de estrés y patrones de crecimiento inconsistentes.
seguimiento de cambio
Para evaluar el rendimiento del represor in vivo, el equipo administró E. coli que contiene el circuito represor a ratones por vía oral, luego analizó las bacterias extraídas de las muestras fecales. El represor permaneció activo hasta 16 días después de la introducción, lo que demuestra que el oscilador a largo plazoLa expresión génica podría mantenerse en las bacterias intestinales de los mamíferos vivos. El análisis RINGS detectó con éxito los cambios en los patrones de crecimiento bacteriano, y las bacterias cuyos circuitos represores estaban en diferentes etapas podrían "sincronizarse" al dar a los ratones un compuesto en su agua potable que detuvo elciclo represor en una etapa dada.
Finalmente, los investigadores probaron la capacidad del represor para detectar diferencias en las tasas de crecimiento bacteriano que se han observado como resultado de la inflamación intestinal. A los ratones se les dio un compuesto inductor de inflamación, seguido de bacterias cargadas de represores. Después de 15 horas, análisis RINGSmostró que las bacterias de los ratones con inflamación tenían represores en un rango más amplio de fases en comparación con las bacterias de los ratones de control, lo que sugiere que la inflamación produce un ambiente que genera inconsistencias en el crecimiento bacteriano, lo que puede conducir a desequilibrios en el microbioma intestinal.
"Este represor nos permite investigar realmente las complejidades del comportamiento bacteriano en el intestino vivo, no solo en estados sanos y enfermos, sino también espacial y temporalmente", dijo la autora correspondiente Pamela Silver, Ph.D., quien es unaMiembro principal de la facultad en el Instituto Wyss y el profesor Elliot T. y Onie H. Adams de Bioquímica y Biología de Sistemas en HMS. "El hecho de que podemos sincronizar de nuevo el represor cuando ya está en el intestino, así como mantenerlo sinla necesidad de administrar antibióticos selectivos también significa que podemos estudiar el microbioma en un estado más natural con una interrupción mínima ".
Además de comprender la dinámica del microbioma, el represador desbloquea el potencial de diagnósticos y terapias complejas, basadas en biología sintética para el intestino humano. Las aplicaciones potenciales incluyen la creación de un sistema que está programado para iniciar una cascada de transcripción génicaen un cierto punto del ritmo circadiano, o un diagnóstico que registra cuánto tiempo ha transcurrido después de la detección de un biomarcador determinado.
"Esta investigación no solo resuelve un problema específico relacionado con el monitoreo de cambios dinámicos en la fisiología del microbioma dentro del intestino vivo, sino que proporciona una plataforma que podría conducir a tipos completamente nuevos de diagnósticos e incluso terapias dependientes del tiempo", dijo el Director Fundador de WyssDonald Ingber, MD, Ph.D., quien también es el profesor de Biología Vascular Judah Folkman en HMS y el Programa de Biología Vascular en el Hospital de Niños de Boston, así como Profesor de Bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.
Los autores adicionales del artículo incluyen a David Richmond, Laurent Potvin-Trottier, Andrew Verdegaal, Somenath Bakshi, Emanuele Leoncini, Lorena Lyon y Johan Paulsson del HMS, y Alexander Naydich del Instituto Wyss, HMS y John A. Paulson de Harvard.Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas. Esta investigación fue apoyada por una beca de largo plazo del Programa de Ciencias Humanas de la Frontera, la Fundación Menzies, el Wellcome Trust, la Fundación Nacional de Ciencias, la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa, la Facultad de Medicina de Harvard y el Instituto Wysspara ingeniería biológicamente inspirada
Fuente de la historia :
Materiales proporcionado por Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en Harvard . Original escrito por Lindsay Brownell. Nota: El contenido puede ser editado por estilo y longitud.
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